El exón17 de BRCA2 presenta un sitio donador de splicing atípico (GC), que aparecen en un 1% de los intrones humanos (Kralovicova et al., 2011). Su reconocimiento debe estar mediado por reguladores en el exón e intrón 17 y/o el exón 18. De esta forma, las mutaciones que afecten a estas secuencias podrían alterar el proceso de splicing de BRCA2 y estar así asociadas a cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH). En este estudio, construimos un minigen en plásmido reportero de splicing pSAD® con los exones de 14 a 20 de BRCA2 para el estudio del splicing de los exones 17 y 18 en su contexto genómico, así como para evaluar el impacto funcional de mutaciones sobre este proceso. Se analizaron in silico el exón e intrón 17 y el exón 18 de BRCA2, para mapear los putativos sitios crípticos y los motivos ESE y ESS. Se analizaron 66 mutaciones del exón 17 y 145 del exón 18 con NNSplice y HSF, recogidas en BIC y UMD. Se seleccionaron 31 mutaciones candidatas de splicing en el exón 18 y 14 en el exón 17. Se construyó un minigen híbrido 14-20 de BRCA2. Las variantes seleccionadas fueron generadas en el minigen mediante mutagénesis dirigida y ensayadas funcionalmente en células HeLa. El MGBR14-20 produjo un transcrito estable de tamaño (2046nt) y estructura (V1-BRCA2 exones 14 a 20-V2) esperados. Las predicciones bioinformáticas coinciden con los resultados del estudio de elementos reguladores de splicing mediante microdeleciones solapantes. Hasta la fecha, se han ensayado 24 mutaciones (10 del exón 17 y 14 del exón 18), de las cuales 15 (62.5%) alteran el splicing. Once (46%) inducen anomalías mayoritariamente con transcritos aberrantes con codones stop prematuros o deleciones in-frame de regiones esenciales de la proteína BRCA2, de modo que podían ser clasificadas como patogénicas. Las alteraciones más frecuentemente encontradas son: exón skipping, uso de sitios crípticos de splicing y uso de aceptores o donadores de novo. Cabe destacar que 7 de las 12 mutaciones missense estudiadas (58%) provocaron este tipo de alteraciones. El minigen MGBR2 14-20 es una herramienta robusta para el estudio de mutaciones en los exones 17 y 18 debido a su estabilidad y al mantenimiento del contexto genómico con un total de 7 exones. El estudio de mutaciones que puedan afectar al proceso de splicing resulta de vital importancia, pues variantes de significado clínico incierto provocan graves alteraciones en el transcrito de BRCA2, y podrían ser reclasificadas como patogénicas.

EAV lab is supported by grant Fis: PI13/01749 from the Spanish Ministry of Economy and Competitivity, Plan Nacional de I+D+I 2013-2016, ISCIII, co-funded by FEDER from Regional Development European Funds (European Union), and grant CSI090U14 (ORDEN EDU/122/2014) from the Consejería de Educación (Junta de Castilla y León, Spain). EFB is supported by a predoctoral fellowship from the University of Valladolid (2015-2019).

Póster presentado al XL Congreso de la Sociedad Española de Genética, celebrado en Córdoba del 16 al 18 de septiembre de 2015.

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