[ES] La leishmaniasis es una enfermedad causada por distintas especies del género Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) con una incidencia estimada anual de entre 900.000 y 1,8 millones de casos. L. infantum es el agente etiológico responsable de la leishmaniasis visceral zoonótica en la que el perro es el principal reservorio en la cuenca mediterránea. Leishmania spp. tiene un ciclo digenético en el que se alternan el estadío promastigote extracelular en el tubo digestivo del vector, Phlebotomus, con el estadío amastigote inmóvil en el interior de los macrófagos del hospedador mamífero. La terapia actual frente a la leishmaniasis está muy limitada debido a su toxicidad, elevado coste y al desarrollo de resistencias y recidivas. En el presente trabajo, la tirosina aminotransferasa de L. infantum (LiTAT) se ha identificado como una enzima importante en el metabolismo del parásito. LiTAT es una proteína citoplasmática que está involucrada en el primer paso de la ruta de degradación de aminoácidos aromáticos, el cual consiste en la transaminación del grupo amino desde un aminoácido a un oxoácido. Como ocurre en T. cruzi, el producto final de la ruta de degradación de la tirosina (el ácido p-hidroxifenil láctico), que se ha asociado a la patogenia de la enfermedad en otros tripanosomátidos, es excretado en gran cantidad por los promastigotes al medio de cultivo, lo que es indicativo de una ruta metabólica muy activa. El porcentaje de identidad de secuencia de LiTAT con la proteína ortóloga en mamíferos es del 37% y la especificidad frente a los sustratos oxoácidos entre ambas es muy distinta. La expresión de la proteína se confirmó tanto en promastigotes en fase logarítmica temprana, como en amastigotes. El hierro es un factor necesario para el inicio de la expresión de LiTAT en fase logarítmica temprana. Por otro lado, la degradación de LiTAT puede ser eludida por la deleción del extremo N-terminal de 38 aminoácidos y por la inhibición de la subunidad 26S del proteasoma. En promastigotes en fase estacionaria, la proteína sólo se expresa en la subpoblación metacíclica con mayor capacidad infectiva. Además, LiTAT se sobre-expresa en una cepa de L. infantum (chagasi) resistente a óxido nítrico. Dicha sobre-expresión podría explicarse por su interacción con la malato descarboxilasa, responsable, entre otras, de la síntesis de piruvato a partir de malato produciendo NADPH, requerido en la protección frente a estrés oxidativo. Todo esto hace de LiTAT una buena diana terapéutica para el desarrollo de nuevos compuestos inhibidores. Por ello, mediante cristalografía de rayos X, se ha resuelto la estructura de la proteína LiTAT a una resolución de 2,35 Å. Esto ha permitido dilucidar el mecanismo de reacción que se produce durante el proceso de transaminación en el centro activo de la enzima y ha permitido el desarrollo de un grupo farmacóforo con el que poder identificar nuevas moléculas que podrían inhibir la actividad de la enzima.

[EN] Leishmaniasis is a disease caused by species of the genus Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) with an estimated annual incidence comprised between 900,000 and 1.8 million cases. L. infantum is the etiological agent responsible for zoonotic visceral leishmaniasis being the dog the main reservoir in the Mediterranean basin. Leishmania spp. develops a digenetic biological life cycle which alternates the extracellular promastigote form within the midgut of the vector Phlebotomus with the immobile intramacrophage amastigote stage in the mammalian host. Current treatment options of leishmaniases are limited due to their toxicity, high cost and the development of increasing resistances and relapses. In this work, L. infantum tyrosine aminotransferase (LiTAT) has been identified as an important enzyme in the metabolism of the parasite. LiTAT is a cytoplasmic enzyme involved in the first step of the aromatic amino acids degradation pathway which is based on the transamination of the amino group of an amino acid to an oxoacid. As in T. cruzi. the end-product of the tyrosine degradative pathway (p-hydroxyphenyl lactic acid), which has been associated to the pathogeny in other trypanosomatids, is excreted in big amounts by promastigotes in axenic culture indicating a highly activated pathway. The percentage of sequence identity between LiTAT and the mammalian orthologue is 37% and the reactivity is rather different between both orthologues. Expression of the protein was confirmed in both, the amastigote and in the early-logarithmic stage of promastigotes. The iron is required to initiate the expression of LiTAT in early-logarithmic stage. On the other hand, the degradation of LiTAT can be avoided by the deletion of the first 38 amino acids located in the N-terminal and by the inhibition of the subunit 26S in the proteasome. Within the stationary stage of promastigotes it is only expressed in the more infective metacyclic subpopulation. Moreover LiTAT is over-expressed in a nitric oxide resistant strain of L. infantum (chagasi). This over-expression may be explained because LiTAT seems to be able to interact with the malic decarboxylase enzyme, which is responsible, among others, of the pyruvate synthesis from malate producing NADPH which is necessary for the protection against the oxidative stress. All these reasons make LiTAT a good candidate for the development of new inhibitors. Consequently the PLP-bonded structure of this enzyme was solved by X-ray crystallography at 2.35 Å of resolution. A comprehensive basis for the mechanism of the transamination in the active center allowed a structure-based development of a pharmacophore group for the identification of new molecules which may inhibit the activity of the enzyme.

151 p.-49 fig.-10 tab.-anexos.

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