La prevalencia de la alergia alimentaria se ha incrementado considerablemente en los últimos años, llegando a verse afectados hasta un 5% de las personas adultas y un 8% de los niños en edad escolar. El 90% de estas alergias son provocadas por ocho alimentos: cacahuetes, frutos secos, huevos, leche, pescado, crustáceos, trigo y soja. El potencial alergénico de las proteínas alimentarias es principalmente evaluado en modelos animales y es fundamental contar con estrategias que permitan estudiar adecuadamente los posibles mecanismos inmunológicos subyacentes a la sensibilización alérgica. Entre las posibles estrategias utilizadas, destaca la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) ya que permite la monitorización conjunta de un amplio número de moléculas implicadas. El presente trabajo tiene como finalidad optimizar sistemas de RT-qPCR que permitan el estudio de la expresión de los principales genes involucrados en la sensibilización en un modelo múrido de alergia a la clara de huevo. En primera instancia se procedió a seleccionar la pareja de cebadores óptima para cada gen objeto de estudio (FoxP 3, GATA 3, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17, IL-22, IL-25, IL-33, T-bet, TGF-β y TSLP), para posteriormente, llevar a cabo la puesta a punto de las condiciones de reacción de RT-qPCR (temperaturas, tiempos y concentraciones de los cebadores). Además, se evaluó la eficiencia y sensibilidad de los sistemas desarrollados. Finalmente, se obtuvieron muestras de ARN a partir de duodeno, placas de Peyer y nódulos linfáticos mesentéricos procedentes de ratones naïve y sensibilizados a clara de huevo para la validación de los sistemas de RT-qPCR optimizados. Una vez analizadas in silico las posibles parejas de cebadores para cada gen, se seleccionaron aquellas que más se aproximaban a los criterios teóricos óptimos. En el caso de IL-17 fue necesario llevar a cabo el diseño de una nueva pareja de cebadores. Además, se seleccionaron dos condiciones de la reacción de RT-qPCR que permitieron la adecuada amplificación de todos los genes objeto de estudio basándose en el desarrollo de curvas de eficiencia cuyo porcentaje varió entre 89-110%. La sensibilidad de los sistemas desarrollados se estableció en 0,05 y 0,005 ng de ARN, dependiendo del gen. Por último, se comprobó que los sistemas de RT-qPCR optimizados eran capaces de discriminar los procesos inmunológicos de la sensibilización a la clara de huevo en muestras integras y puras de ARN procedentes de ratón.

Resumen del póster presentado a las II Jornadas Científicas CIAL-Fórum, celebradas durante los dias 16 y 17 de noviembre de 2016 en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL).

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