Las arrestinas tienen un papel clave en el tráfico intracelular de los receptores de siete hélices transmembrana. En laruta de señalización por pH ambiental de levadura están implicadas tanto una proteína de la familia de las arrestinas, Rim8, como la maquinaria ESCRT (complejos de clasificación endosomal necesarios para el transporte). Hemos demostrado previamente que la E3 ubiquitina ligasa Rsp5 monoubiquitina el extremo C-terminal de Rim8. Además, esta modificación es dependiente de su asociación con el dominio UEV de unión a ubiquitina de la subunidad Vps23 del complejo ESCRT-I. Para determinar si este dominio de unión a ubiquitina participa activamente en la modificación de Rim8, hemos puesto a punto un ensayo de ubiquitinación in vitro en el que utilizamos el extremo C-terminal de Rim8 como sustrato. Nuestros resultados indican que Rim8 se poliubiquitina in vitro y que esta modificación es dependiente de la unión de Rsp5 a un motivo PXY en Rim8. De forma notable, la adición del dominio UEV de Vps23 a la mezcla de reacción inhibe la formación de cadenas de ubiquitina y genera la formación de sustrato modificado con una única molécula de ubiquitina (monoubiquitinado). Este efecto es específico ya que no se observa con el dominio UEV de la proteína Mms2. Por otra parte, la inhibición de la poliubiquitinación de Rim8 es dependiente de la unión del dominio UEV de Vps23 con ubiquitina y con un motivo SXP próximo al residuo ubiquitinado. Finalmente, confirmamos in vivo el papel de Vps23 en el bloqueo de la poliubiquitinación de Rim8 ya que la expresión de ubiquitina mutante, que no permite la formación de cadenas de ubiquitina, restaura la ubiquitinación de Rim8 en ausencia de Vps23. Ya que la extensión de la cadena de ubiquitina requiere la unión del lóbulo N del dominio HECT de Rsp5 a la primera molécula de ubiquitina conjugada, proponemos un modelo en el que el dominio UEV de Vps23 compite con esta interacción, y evita así que se produzcan las sucesivas rondas de reacción. Estos hallazgos revelan un nuevo mecanismo de control de la longitud de cadenas de ubiquitina conjugadas a proteínas sustrato.

Resumen del póster presentado al XXXVI Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Madrid del 3 al 6 de septiembre de 2013.

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