La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía inflamatoria de carácter autoinmune, que se produce tras la ingestión de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Actualmente representa una de las enfermedades genéticas más comunes, con una prevalencia de 1:100 personas a nivel mundial. Actualmente se conocen los principales péptidos del gluten responsables de la EC, son péptidos con un elevado porcentaje de residuos de prolina que les confieren una elevada resistencia a la proteólisis gastrointestinal, por lo que se acumulan en el lumen intestinal desencadenando la respuesta inmune. Entre ellos destaca un péptido de 33 aminoácidos (33-mer) proveniente de la ¿/ß-gliadina, conocido por ser el péptido más inmunotóxico del gluten. El único tratamiento disponible para la EC es seguir una estricta dieta libre de gluten durante toda la vida del paciente, por lo que es necesario y urgente el desarrollo de nuevas terapias alternativas o complementarias que mejoren la calidad de vida de los pacientes celiacos. Durante los últimos años, se han propuesto distintos tratamientos que se encuentran en diferentes fases de investigación. Entre ellos se encuentra la terapia enzimática oral, que se basa en la administración de enzimas específicos capaces de degradar los péptidos del gluten en el tracto gastrointestinal (TGI). Se propuso el uso del enzima prolil endopeptidasa de Myxococcus xanthus (PEPMx) y el de Sphingomonas capsulata (PEPSc) como candidatos para la hidrólisis de los péptidos inmunotóxicos del gluten, sin embargo estos microorganismos no pueden ser incluidos en alimentos. Dado que las bacterias del ácido láctico (BAL) son microorganismos reconocidos como seguros, que forman parte de nuestra alimentación y de nuestra microbiota intestinal, junto al hecho de que poseen un sistema proteolítico muy extenso y variado, en la presente Tesis Doctoral propusimos utilizar BAL que sean capaces de hidrolizar los péptidos inmunotóxicos del gluten en el TGI, como terapia alternativa de la EC. Con el fin de alcanzar dicho objetivo se han seguido dos estrategias diferentes, por un lado la búsqueda en nichos ecológicos variados de BAL silvestres capaces de hidrolizar el péptido 33-mer y por otro lado, la generación de BAL recombinantes que sinteticen PEP para hidrolizar los péptidos del gluten. I. Búsqueda de BAL capaces de degradar la gliadina y el péptido 33-mer En primer lugar, se desarrolló un medio de cultivo que contiene gliadina como única fuente de nitrógeno (AHG-M), que permitió seleccionar en muestras complejas bacterias capaces de hidrolizar la gliadina. Se seleccionaron aquellas bacterias capaces de formar un halo claro alrededor de la colonia debido a la degradación de la gliadina. A continuación, se identificaron y se tipificaron molecularmente obteniendo 29 cepas de BAL diferentes capaces de crecer y formar halo en AHG-M. Se analizó la resistencia de las 29 cepas seleccionadas a varios antibióticos mediante la técnica de microdilución en caldo. Con el objetivo identificar las posibles actividades enzimáticas implicadas en la hidrólisis de la gliadina, se cuantificaron varias actividades peptidasas específicas para la hidrólisis de residuos de prolina. A continuación, se evaluó la capacidad de las cepas seleccionadas para hidrolizar el péptido de 33-mer, obteniendo que 5 de las 29 cepas fueron capaces de degradar completamente el péptido en las condiciones ensayadas. Se seleccionaron las mejores candidatas y se evaluó su capacidad para sobrevivir al paso por las condiciones del TGI simuladas in vitro. Con el fin de identificar aquellas actividades que pudieran estar implicadas en la hidrólisis del péptido inmunotóxico, se secuenció el genoma de la mejor candidata.

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