A qualidade do ar interior em ambiente hospitalar é um fator essencial no controlo de infeções nosocomiais. Este estudo teve por objetivo determinar as concentrações de microrganismos e material particulado (PM) em suspensão no ar interior de um Bloco operatório e identificar, por métodos moleculares, os microrganismos presentes. Utilizou-se a técnica de impacto em meio sólido para determinar as concentrações de bactérias e fungos e paralelamente utilizou-se um espectrómetro portátil para medir as partículas em suspensão. As menores concentrações de bactérias e de fungos foram observadas nas salas de cirurgia e as maiores na antecâmara. Os géneros bacterianos com maior prevalência foram Staphylococcus, Micrococcus e Bacillus e os fúngicos foram Penicillium, Cladosporium, Rhodotorula e Aspergillus. Verificou-se uma correlação forte (r ≥ 0,9) entre as concentrações médias de bactérias, fungos e a concentração de material particulado, expressa em número de partículas por centímetro cúbico, demonstrando que o material particulado pode ser usado de forma indireta como indicador de qualidade do ar interior, uma vez que estes parecem estar associados aos microrganismos aerotransportados. A ausência de ventilação mecânica na antecâmara demonstrou ter importância na acumulação de poluentes. Compreender as condições do ambiente avaliado é estratégia fundamental na aplicação de medidas de controlo.