Une mutation récessive appelée fragilitas ossium (retour) dans le gene Sphingomyélinase 3 (Smpd3) conduit à une altération de la minéralisation de la matrice extracellulaire des os et des dents chez la souris fro/fro. SMPD3 (également connu sous le nom nSMase2) clive la sphingomyéline présente dans la membrane cellulaire pour produire la céramide, une molécule lipidique bioactive, et la phosphocholine, un nutriment essentiel. Nous avons examiné l'ossification endochondrale dans des embryons de souris fro/fro à E15.5 et avons observé une altération de l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques et un défaut de minéralisation de l'os cortical dans le squelette en développement. Afin de déterminer si SMPD3 joue un rôle cellulaire autonome dans ces tissus, nous avons examiné, in vitro, la minéralisation de cultures d'ostéoblastes fro/fro; la minéralisation est moindre dans les cultures d'ostéoblastes fro/fro que dans les cultures témoins. Nous avons ensuite produit la souris fro/fro;Co11a1-Smpd3, dans laquelle l'expression de Smpd3 dans les ostéoblastes corrige les anomalies osseuses observées dans les embryons fro/fro sans toutefois corriger le phénotype du cartilage. Le transgène COL1A1-Smpd3 est également exprimé dans les odontoblastes et cette expression était suffisante pour corriger tous les défauts de minéralisation des dents de la souris fro/fro; COL1A1-Smpd3. Nous avons observé une diminution des niveaux de céramide dans divers tissus de la souris fro/fro. Une diminution similaire des niveaux de céramide est également rapporté lors de l'inactivation de la voie de novo de la synthèse des céramides dans la souris Des1-/-. Cependant, nous avons constaté que la souris Des1-/- ne présente aucun défaut de minéralisation osseuse. Cette observation soulève la possibilité que l'autre métabolite SMPD3, phosphocholine, pourrait jouer un rôle dans la minéralisation osseuse. Un déficit de la phosphatase orpheline 1 (PHOSPHO1), une enzyme intracellulaire qui clive phosphocholine pour générer sans phosphate et de la choline, a été associée à une mauvaise minéralisation osseuse. Notre analyse histologique des os de souris homozygotes composés fro/fro;Phospho1-/- âgés de quatre semaines a montré que la quantité d'ostéoïde ne différait pas de celle des os des souris témoins fro/fro. En plus de la voie de la sphingomyélinase, phosphocholine peut également être obtenue par des kinases cytosoliques de choline qui peuvent convertir les cholines de l'alimentation en phosphocholine. Partant de ce constat, nous avons nourri les souris fro/fro et Phospho1-/- avec un régime alimentaire contenant 2 % de cholines. Ce régime riche en colines a permis d'augmenter les niveaux de choline sérique et de diminuer le volume osseux non minéralisée (ostéoïde) chez la les souris fro/fro mais pas chez les phospho1-/-. Ensemble, nos données suggèrent que SMPD3 joue un rôle cellulaire autonome dans les ostéoblastes et odontoblastes en régulant, respectivement, la minéralisation des os et des dents. De plus, nous montrons que SMPD3 agit en amont de PHOSPHO1, et que le métabolisme de la choline peut jouer un rôle important dans la minéralisation des tissus solides.

A recessive mutation called fragilitas ossium (fro) in the sphingomyelin phosphodiesterase 3 (Smpd3) gene leads to impaired mineralization of bone and tooth extracellular matrix in fro/fro mice. SMPD3 (also known as nSMase2) cleaves sphingomyelin present in the cell membrane to generate ceramide, a bioactive lipid molecule, and phosphocholine, an essential nutrient. We examined endochondral ossification in E15.5 fro/fro mouse embryos and observed impaired apoptosis of hypertrophic chondrocytes and severely undermineralized cortical bones in the developing skeleton. To investigate whether SMPD3 plays a cell-autonomous role in these tissues, we examined the in vitro mineralization properties of fro/fro osteoblast cultures; the fro/fro cultures mineralized less than the control osteoblast cultures. We next generated fro/fro;Col1a1-Smpd3 mice, in which expression of Smpd3 in osteoblasts corrected the bone abnormalities observed in fro/fro embryos without correcting the cartilage phenotype. The Col1a1-Smpd3 transgene was also expressed in odontoblast and this expression was sufficient to correct all the tooth mineralization defects in fro/fro;Col1a1-Smpd3 mice. We observed a decrease of ceramide levels in various fro/fro tissues. A similar decrease of ceramide levels is also reported upon the inactivation of the de novo pathway of ceramide synthesis in Des1-/- mice. However, we found that Des1-/- mice do not show any bone mineralization defects. This observation raises the possibility that the other SMPD3 metabolite, phosphocholine, might play a role in bone mineralization. The deficiency of phosphatase, orphan 1 (PHOSPHO1), an intracellular enzyme that cleaves phosphocholine to generate free phosphate and choline, has been associated with poor bone mineralization. Our histological analyses of the bones of 4-week-old fro/fro;Phospho1-/- compound homozygotes showed that the osteoid amount did not differ from that of control fro/fro bones. In addition to the sphingomyelinase pathway, phosphocholine can also be generated by cytosolic choline kinases that can convert dietary choline to phosphocholine. Based on this finding, we fed both fro/fro and Phospho1-/- mice a 2%-choline diet. This choline-rich diet raised the serum choline levels and decreased the unmineralized bone (osteoid) volume in fro/fro mice but not in phospho1-/- mice. Taken together, our data suggest that SMPD3 plays a cell-autonomous role in osteoblasts and odontoblasts to regulate bone and tooth mineralization, respectively. Additionally, we show that SMPD3 acts upstream of PHOSPHO1, and choline metabolism may play an important role in hard tissue mineralization.

Murshed, Monzur (Supervisor)