Les depsipeptides cycliques sont des produits naturels d’importance industrielle et médicale générés par des enzymes de synthèse de peptides non ribosomiques (NRPS), qui emploient un vaste répertoire de mécanismes biosynthétiques. Par exemple, les synthétases des depsipeptides céreulide (Ces) et valinomycine (Vlm) produisent des précurseurs linéaires par la condensation alternée d’acides aminés et d’acides hydroxylés. Ces derniers sont incorporés par des modules spécialises contenant des domaines d’adénylation (A), cétoréductase (KR) et protéine porteuse de peptide (PCP). Un domaine thioestérase itératif (TE) catalyse ensuite la cyclisation ou l’oligomérisation du précurseur linéaire et libère le produit final.Afin de caractériser au niveau biochimique les modules spécialises qui incorporent les acides hydroxylés dans le système Ces, j’ai exprimé et purifié ses composantes intactes, effectué des analyses sur les domaines en question, et reconstitué l’assemblage du précurseur de depsipeptide linéaire in vitro, démontrant que les quinze domaines du système sont actifs et agissent de concert.Les domaines A et KR adénylent et réduisent les acides alpha-cétoniques, produisant les acides alpha-hydroxylés présents dans les depsipeptides cycliques. Avec mes collaborateurs, j’ai déterminé la structure de la portion A-KR adoptant la conformation d’adénylation, illustrant la connexion des domaines KR et PCP par un nouvel élément structurel engagé dans l’échange de domaines. J’ai aussi obtenu la structure à haute résolution du domaine A lié au produit de sa première demi-réaction, démontrant pour la première fois comment le groupe cétone interagit avec ce domaine.Enfin, j’ai déterminé les structures du domaine TE de Vlm lié aux intermédiaires des réactions d’oligomérisation et de cyclisation, en employant une approche d’expansion du code génétique et des analogues de substrats, développée par mes collaborateurs. Cette étude est la première visualisation de la structure quasi-native de TE avec substrats, nous informant du rôle du « couvercle » du site actif – un élément structurel présent dans tous les domaines TE. De plus, ces résultats démontrent la faisabilité de l’approche d’expansion du code génétique, offrant la possibilité de son application à d’autres systèmes biologiques.En résumé, cette thèse étend nos connaissances de la synthèse des depsipeptides. Ces nouvelles informations pourraient être applicables aux machines moléculaires produisant d’autres depsipeptides tels le piscicide antimycine, l’agent anticancéreux cryptophycine et l’agent antifongique kutzneride

Cyclic depsipeptides, ubiquitous natural products of industrial and medical importance, are produced by nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using a diverse repertoire of biosynthetic mechanisms. For instance, cereulide (Ces) and valinomycin (Vlm) depsipeptide synthetases generate a linear precursor by the alternate condensation of hydroxy and amino acids. Hydroxy acids are added by specialized modules consisting of adenylation (A), ketoreductase (KR) and peptidyl carrier protein (PCP) domains, while an iterative thioesterase (TE) domain catalyzes the oligomerization/cyclization of the linear precursor to release the mature product.In order to perform a biochemical characterization of the specialized modules that add hydroxy acids in the Ces system, I expressed and purified its intact components, performed biochemical assays on the relevant domains and reconstituted the assembly of the linear depsipeptide precursor in vitro, showing that the 15 domains in the system were active and working in concert. A and KR domains adenylate and reduce -ketoacids to generate the constituting -hydroxy acids in cyclic depsipeptides. I and collaborators determined a di-domain A-KR structure in the adenylation conformation, showing how a novel structural element connects the KR and PCP domains while participating in domain swapping. I also determined the high-resolution structure of an excised A domain bound to the product of its first half-reaction, demonstrating how the ketone group interacts with the A domain for the first time.Finally, I determined the structures of Vlm TE bound to intermediates of the oligomerization and cyclization reactions, using a genetic code expansion strategy and substrate analogues developed by our collaborators. This work presents near-native TE-substrate structures for the first time and provides information on the role of the active site lid, a structural element present in all TE domains. Furthermore, these results serve as a proof of concept for the genetic code expansion strategy, opening the possibility of its use in other biological systems.In general, this dissertation provides novel information on depsipeptide biosynthesis, which could be extrapolated to the machinery producing other depsipeptides such as the piscicide antimycin, the anticancer agent cryptophycin and the antifungal kutzneride

Schmeing, Thomas Martin (Supervisor)