Le NADP+ et le NADPH sont impliqués dans plusieurs voies de biosynthèse ainsi que dans les mécanismes de signaux de transduction. La NAD Kinase (NADK) est la seule enzyme connue qui catalyse la synthèse de novo du NAD+ en NADP+. Dans les neutrophiles, la NADK joue un rôle essentiel à la formation de niveaux suffisants de NADPH nécessaires à une explosion respiratoire puissante. De plus, il procurerait le NADP+ nécessaire à la synthèse du chimioattractant de granulocytes, le 5oxo-ETE. Malgré son rôle majeur, très peu est encore connu sur son rôle de régulateur chez les mammifères. L'activation de la NADPH oxidase-2 (NOX-2) dans les neutrophiles par des activateurs de la PKC, comme le PMA, provoque une explosion respiratoire puissante, dans lequel un superoxide est formé à partir de l'oxygène provenant de l'oxydation du NADPH en NADP+. Dans cette étude, nous avons mesuré les niveaux de nucléotides pyridines par HPLC, après traitement de neutrophiles avec du PMA. Une augmentation rapide des niveaux de NADP+ fut observée, mais contrairement à ce qui était attendue, celle-ci n'était pas accompagnée d'une diminution de NADPH, qui initialement à aussi augmenté, mais plutôt par une diminution de NAD+. L'augmentation de la formation de NADP+ était exactement comparable à la diminution des niveaux de NAD+, suggérant que la NADK a été activée. Nous avons confirmé que la diminution de NAD+ induite par le PMA dans des neutrophiles intacts, n'est pas dépendante de NOX-2, puisqu' il n'est pas bloqué par l'inhibiteur de NOX-2, le DPI. Des hybridations Western d'un lysat de neutrophiles avec un anticorps monoclonal anti-NADK a révélé une bande intense avec les neutrophiles traités au PMA mais seulement une bande très faible avec des neutrophiles traités avec le véhicule, suggérant que la PKC induit une modification post-traductionnelle sur la NADK menant à une augmentation de sa réactivité immunologique. Nous avons aussi démontré que la PKC influence l'augmentation de l'activité enzymatique et immunologique de la NADK induite par le PMA, puisqu'elle est bloquée par les inhibiteurs de la PKC : staurosporine et GO6983. L'immunoréactivité du recombinant NADK a augmenté de façon importante à la suite du traitement avec la PKC-delta. L'exposition au PMA ou avec la PKC semble induire la phosphorylation de NADK dans les neutrophiles et du recombinant de NADK, respectivement. L'analyse par LC MS/MS de la NADK a révélé qu'elle est partiellement phosphorylée sur S46, S48, S64 et T62 dans les neutrophiles au repos et que la phosphorylation de S46 et S64 augmente de façon significative à la suite de l'exposition des neutrophiles au PMA. De façon similaire, le PKC-delta induit la phosphorylation de la protéine recombinante NADK sur S46, S55 et S64 et augmente de façon importante son immunoréactivité avec l'anticorps monoclonal. Ces résultats suggèrent que l'immunoréactivité accrue de la NADK à la suite du traitement au PMA est due à la phosphorylation de S46 et/ou S64. Étant donné que la phosphorylation in vitro du recombinant NADK n'a pas affecté son activité enzymatique, nous émettons l'hypothèse que la PKC régularise l'activation de la NADK à travers les changements induits par la phosphorylation qui influence les interactions avec d'autres protéines. Nous avons obtenu des évidences préliminaires suggérant que dans les neutrophiles au repos, la NADK interagit avec la protéine 14-3-3 zeta et que cette interaction est réduite à la suite du traitement avec le PMA. Ceci suggère que la phosphorylation de la NADK induit un changement de conformation menant à une dissociation de la protéine 14-3-3 ou d'une protéine connexe adaptatrice inhibitrice et a l'activation de la NADK. La phosphorylation de la NADK par la PKC pourrait donc être un mécanisme important de régulation pour fournir des niveaux suffisants de NADPH et ainsi supporter une importante explosion respiratoire dans les cellules phagocytaires.

NADP+ and NADPH are involved in many biosynthetic pathways and signal transduction mechanisms. NAD kinase (NADK) is the only known enzyme that catalyzes the de novo synthesis of NADP+ from NAD+. In neutrophils, NADK plays an essential role to provide sufficient levels of NADPH to support a robust respiratory burst. Additionally, it would provide the NADP+ that is required for the synthesis of the potent granulocyte chemoattractant, 5-oxo-ETE. Despite the critical role of NADK, very little is known about its regulatory mechanisms in mammals. Activation of NADPH oxidase-2 (NOX-2) in neutrophils by stimulators of PKC, such as PMA, results in a robust respiratory burst, in which superoxide is generated from oxygen at the expense of oxidation of NADPH to NADP+. In this study, we measured the levels of pyridine nucleotides following the addition of PMA to neutrophils. The expected rapid rise in NADP+ levels was observed, but, contrary to expectations, this was not accompanied by the loss of NADPH, which initially also increased, but rather by the depletion of NAD+. The time course for NADP+ formation was precisely mirrored by a comparable decline in NAD+ levels, suggesting that NADK had been activated. We confirmed that the PMA-induced depletion of NAD+ in intact neutrophils is not dependent on NOX-2, since it is not blocked by the NOX inhibitor, DPI. Western blotting of neutrophil lysates with a monoclonal anti-NADK antibody revealed an intense band in PMA-treated neutrophils but only a very weak band in vehicle-treated neutrophils, suggesting that PKC induces a post-translation modification on NADK leading to an increase in its immunoreactivity. We also showed that the PMA-induced increases in NADK enzymatic activity and immunoreactivity are mediated by PKC, as they were blocked by the PKC inhibitors staurosporine and GO6983. The immunoreactivity of recombinant GST-NADK was also shown to dramatically increase following treatment with PKC-delta. Exposure to PMA or PKC appears to induce the phosphorylation of neutrophil NADK and recombinant NADK, respectively. LC-MS/MS analysis of NADK revealed that it is partially phosphorylated on S46, S48, S64 and T62 in resting neutrophils and that phosphorylation of S46 and S64 is markedly increased following exposure of neutrophils to PMA. Similarly, PKC-delta induced phosphorylation of recombinant GST-NADK on S46, S55 and S64 and dramatically increased its immunoreactivity with the monoclonal antibody. These results suggest that the increased immunoreactivity of NADK following treatment with PMA is due to phosphorylation of S46 and/or S64. As in vitro phosphorylation of recombinant GST-NADK did not affect its enzymatic activity, we hypothesize that PKC regulates activation of NADK through phosphorylation-induced changes in its interaction with other proteins. We obtained preliminary evidence that in resting neutrophils NADK interacts with 14-3-3 zeta protein, and that this interaction is reduced following treatment with PMA. This suggests that phosphorylation of NADK induces a conformational change leading to dissociation of 14-3-3 or a related inhibitory adapter protein, and activation of NADK. Phosphorylation of NADK by PKC could therefore be an important regulatory mechanism for providing sufficient levels of NADPH to support a robust respiratory burst in phagocytic cells.

Powell, William S. (Supervisor)