Dans la recherche de nouveaux agents antifongiques, une approche consiste à exploiter la biodiversité d'écosystèmes microbiens mal caractérisés tels que l'Arctique. Nous avons découvert qu'un extrait organique du surnageant de culture d'une nouvelle espèce arctique de Streptomyces, Streptomyces A28, présentait une activité antifongique à large spectre. Nous avons émis l'hypothèse que l'agent actif de cet extrait pourrait être un antifongique efficace contre les pathogènes fongiques humains, et nous avons entrepris d'identifier l'agent actif, de caractériser son index thérapeutique et d'étudier son mécanisme d'action. La chromatographie liquide et la spectrométrie de masse ont permis d'identifier l'agent actif comme étant la staurosporine (STS). L'activité antifongique de la STS contre une série de champignons a été déterminée par des essais de microdilution en bouillon, et la cytotoxicité du composé a été évaluée contre la lignée cellulaire humaine A549. Dans l'ensemble, le STS s'est révélé être un antifongique à large spectre in vitro. Lorsque l'efficacité antifongique du STS a été évaluée in vivo dans un modèle murin d'aspergillose pulmonaire invasive, elle s'est avérée significativement protectrice. Pour comprendre le mécanisme d'action du STS, nous avons effectué une analyse phosphoprotéomique et une quantification des sucres de la paroi cellulaire sur A. fumigatus traité au STS. Nous avons constaté que le traitement au STS avait un impact sur les états de phosphorylation de plusieurs synthases de sucres de la paroi cellulaire et de protéines de la voie d'intégrité de la paroi cellulaire. L'une des protéines phosphorylées à la baisse était la β-(1,3)-D-glucan synthase Fks1, et nous avons constaté une diminution correspondante du β-(1,3)-D-glucan dans la paroi cellulaire d'A. fumigatus traitée au STS. Sur la base de ces résultats, nous avons recherché une synergie entre le STS et les antifongiques existants au moyen d'essais en damier et in vivo. Nous avons découvert une synergie in vitro entre les STS et les échinocandines contre A. fumigatus, bien que cette synergie n'ait pas pu être confirmée in vivo. Ce projet montre que les produits naturels identifiés peuvent offrir des possibilités et de nouvelles directions de recherche pour le développement d'antifongiques grâce à la vérification de leur activité antifongique et à l'étude de leurs mécanismes d'action

In the search for new antifungal agents, one approach is to mine the biodiversity of poorly characterized microbial ecosystems such as the Arctic. We found that an organic extract of the culture supernatant of a novel arctic Streptomyces species, Streptomyces A28, exhibited broad-spectrum antifungal activity. We hypothesized the active agent in this extract could be an effective antifungal against human fungal pathogens and set out to identify the active agent, characterize its therapeutic index, and probe its mechanism of action. Identification of the active agent as staurosporine (STS) was achieved using liquid chromatography and mass spectrometry. The antifungal activity of STS against a range of fungi was determined by broth microdilution assays, and the cytotoxicity of the compound was evaluated against the human A549 cell line. Overall, STS was found to be a broad-range antifungal in vitro. When the antifungal efficacy of STS in vivo was evaluated in a mouse model of invasive pulmonary aspergillosis, it was found to be significantly protective. To understand the mechanism of action of STS, we performed phosphoproteomic analysis and cell wall sugar quantification on STS-exposed A. fumigatus. We found STS exposure impacted the phosphorylation states of several cell wall sugar synthases and proteins within the cell wall integrity pathway. One of the down-phosphorylated proteins was the -(1,3)-D-glucan synthase Fks1, and we found a corresponding decrease in -(1,3)-D-glucan within the STS-exposed A. fumigatus cell wall. Based on these results, we tested for synergy between STS and existing antifungals with checkerboard assays and in vivo. We discovered the in vitro synergy between STS and echinocandins against A. fumigatus, although this synergy could not be confirmed in vivo. This project shows that identified natural products can bring possibilities and new directions of research for antifungal development through verification of their antifungal activity and investigations into their mechanisms of action

Sheppard, Donald (Supervisor)