Podocarpus lambertii (Podocarpaceae) é conhecido popularmente como pinheiro-bravo. Ocorre em várias formações florestais da Mata Atlântica, principalmente na Floresta Ombrófila Mista. Devido à intensa exploração madeireira sofrida pela espécie, ela está presente na categoria “Quase ameaçada” da Lista Vermelha das Espécies Ameaçadas da IUCN. Diante disso, este estudo teve por objetivo caracterizar a diversidade e estrutura genética de 12 populações no Estado de Santa Catarina, a fim de gerar informações para fundamentar estratégias de conservação para a espécie. Foram coletadas folhas de 50 indivíduos adultos em cada população. Para acessar os níveis e a distribuição da diversidade genética, utilizaram-se 10 sistemas enzimáticos. As frequências alélicas, a porcentagem de locos polimórficos (P100%), as heterozigosidades observada (HO) e esperada (HE), o índice de fixação (f) e a divergência genética (FST) foram calculados com auxílio do programa FSTAT. Os 10 sistemas enzimáticos analisados revelaram 11 locos com um total de 32 alelos (A= 1,8). As populações de Podocarpus lambertii apresentaram baixa diversidade genética (P100% = 52,7; HO = 0,049; HE = 0,079). As frequências alélicas das populações apresentaram desvios significativos das esperadas em Equilíbrio de Hardy-Weinberg, evidenciando um deficit de heterozigotos (f = 0,374). A presença de alelos raros nas populações e uma divergência genética significativa (FST = 0,303) evidenciam um baixo fluxo gênico histórico e um grande risco de perda de diversidade. Os resultados obtidos indicam a necessidade de conservação in situ das várias populações de Podocarpus lambertii e de um aumento da conectividade entre as populações remanescentes.