Bakpia Pathok 25 merupakan perusahaan yang memproduksi makan khas jogja yaitu bakpia dan telah berdiri sejak 1948. Sampai saat ini Bakpia Pathok 25 masih menjadi salah satu produsen bakpia yang enak dan terkenal di Yogyakarta sehingga dapat berkembang dan bertahan sampai saat ini. Penelitian ini membahas rute distribusi Bakpia Pathok 25 menggunakan metode Traveling Salesman Problem (TSP) Ant Colony Optimization (ACO). Pendekatan dilakukan untuk mencari rute terbaik agar seorang sopir dapat kembali pulang tepat waktu. Rute awal menunjukkan bahwa sopir melakukan perjalanan dengan rute jarak yang ditempuhnya mencapai 26,19 Km. Setelah menggunakan metode Ant Colony Optimization (ACO) dengan menggunakan MATLAB didapatkan hasil optimal yaitu pada iterasi ke-100 menunjukkan bahwa rute yang digunakan oleh Bakpia Pathok 25 untuk distribusi produk bakpia sudah optimal yaitu dengan rute Toko Pathok Jaya, Toko Ongko Jaya, Toko Pasar Pathok, Toko Bandara Jaya, Toko Kembang Jaya dan kembali menuju Toko Pathok Jaya dengan jarak rute 26.19 Km dan jumlah bahan bakar yang dikeluarkan dengan harga mencapai Rp. 26,190 dalam sekali pendistribusian dan waktu yang didapatkan 54 menit. Penelitian ini diharapkan dapat membantu pihak perusahaan dan mengetahui dalam memilih rute terpendek yaitu rute optimal untuk melakukan distribusi produk bakpia yang diproduksi sehingga dapat meminimalisasi biaya pendistribusian.