Estudo exploratório-descritivo, de abordagem qualitativa, que objetivou descrever o conhecimento das enfermeiras sobre a triagem neonatal e sua operacionalização. Participaram do estudo 13 enfermeiras, atuantes em sete unidades de Estratégia de Saúde da Família em um município do sul do Rio Grande do Sul (RS), no período compreendido entre maio e julho de 2010. Os dados foram coletados em entrevistas semiestruturadas e analisados através da técnica do “Discurso do Sujeito Coletivo”. As enfermeiras entrevistadas demonstraram conhecimento acerca do exame de Triagem Neonatal, especificamente quanto à sua finalidade, o período ideal para coleta de sangue e a técnica para coleta, assim como quanto às doenças que são rastreadas e quais delas o RS está habilitado para diagnosticar. No decorrer deste estudo, ressaltou-se a importância de o profissional da enfermagem buscar continuamente capacitação técnico-científica. Por outro lado, percebeu-se a necessidade dos gestores públicos proporcionem mais oportunidades de qualificação aos profissionais da saúde.