Um método utilizando coluna de imunoafinidade para limpeza e cromatografia em camada delgada, foi otimizado em nosso laboratório para determinar Aflatoxina M1 em baixas concentrações no leite. Para a otimização do método, os parâmetros avaliados foram: recuperação, repetitividade, limite de detecção e limite de quantificação. Baseado em adição de padrão nas amostras, os valores das recuperações variaram de 85,83 e 73,86% em níveis de 0,01–0,5 μg/L, respectivamente, e o desvio padrão relativo para repetitividade variou de 7,73-2,08%. O limite de quantificação estabelecido neste método foi de 0,02 μg/L. Os resultados das amostras analisadas por este método tiveram boa correlação quando comparadas com a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Adicionalmente, o método AOAC também foi otimizado, resultando em um limite de detecção e quantificação de 0,2 e 0,3 μg/L, respectivamente, indicando baixa sensibilidade desse método. A utilização de coluna de imunoafinidade forneceu excelentes resultados na recuperação, sensibilidade e fácil operacionalidade.