Este trabalho estudou parâmetros envolvidos na produção fermentativa do H2 a partir do bagaço de cana- de-açúcar. Primeiramente estudaram-se os fatores: massa de substrato (10, 20, e 30 g/L) e porcentagem de inóculo (10, 20 e 30%). Fixando o melhor resultado desses fatores, estudaram-se os fatores: tempo de aquecimento na pré-hidrólise (0, 30 e 60 min) e pH inicial (5,6 e 7). Os resultados mostraram que as melhores condições avaliadas foram: massa de substrato de 10g/L, 10% de inóculo, pH inicial de 6 e tempo de aquecimento na pré-hidrólise de 30 min, representado pelo ensaio 567 com uma produção específica de hidrogênio de 2,59 mmolH2/gSSVdia. Os principais metabólitos solúveis produzidos foram: ácido acético (478– 1374,2 mg/L), predominante em todos os reatores, ácido propiônico (56,92–59,45 mg/L), etanol (26,46–79,13 mg/L) e metanol (33,71–79,88 mg/L), o que indica que a rota fermentativa utilizada pelos microrganismos para a produção de hidrogênio foi a do ácido acético. Palavras-chave: Bagaço de cana-de-açúcar. Inóculo. Pré-Hidrólise. pH. Fermentação. Produção Específica de Hidrogênio. Metabólitos.