Latar Belakang: Pemeriksaan gula darah sewaktu digunakan sebagai pemeriksaan penyaring (screening) dan memantau (follow up) pada pasien Diabetes Mellitus. Bahan pemeriksaan kadar glukosa darah dapat menggunakan spesimen darah utuh, serum, dan plasma dengan antikoagulan heparin, EDTA, oksalat, dan fluoride. Perbedaan antara plasma dan serum terjadi karena pada serum tidak terbentuk fibrinogen dan beberapa faktor koagulasi lainnya, sedangkan plasma masih mengandung semua protein dan partikel antikoagulan yang dapat mempengaruhi pemeriksaan.Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan kadar glukosa darah sewaktu menggunakan serum dan plasma EDTA. Metode: Jenis penelitian ini observasional analitik, desain potong lintang dan dilakukan di Balai Besar Laboratorium Kesehatan Palembang. Sampel penelitian ini adalah sebanyak 33 sampel,, jumlah sampel ditentukan dengan rumus Lemeshow. Pengambilan sampel menggunakan teknik sampling secara accidental sampling, hingga memenuhi kuota sampel penelitian. Hasil: Hasil penelitian menunjukkan adanya perbedaan terhadap kadar glukosa darah menggunakan serum dan plasma EDTA dengan p value 0,001 (<ɑ 0,05) dengan nilai rata-rata pada serum adalah 100,3 mg/dL serta nilai rata-rata pada plasma EDTA adalah 113,5 mg/dL. Kesimpulan: Nilai rata-rata hasil pemeriksaan kadar glukosa darah menggunakan spesimen serum adalah 91,8 mg/dL sedangkan rata-rata spesimen plasma EDTA adalah 97,2 mg/dL. Hasil uji statistik menyimpulkan ada perbedaan terhadap kadar glukosa menggunakan serum dan plasma EDTA.