Ayam nunukan merupakan plasma nutfah Indonesia yang berkembang di wilayah Kalimantan terutama bagian Utara dan Timur. Tingginya persentase abnormalitas morfologi spermatozoa akan menurunkan nilai fertilitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi abnormalitas bentuk dan akan dikembangkan bahan identifikasi abnormalitas melalui pengecatan menggunakan kombinasi eosin nigrosin. Sepuluh ekor ayam nunukan jantan diatas satu tahun dengan bobot 2-2,5 kg dikoleksi semennya dengan metode massage atau pengurutan bagian punggung (dorsal) ayam jantan. Pembuatan preparat ulas dilakukan dengan menggunakan larutan kombinasi eosin nigrosin. Persentase abnormalitas spermatozoa dihitung dan identifikasi bentuk abnormalitas diamati dengan menggunakan mikroskop. Persentase abnormalitas spermatozoa ayam nunukan sebesar 13,01±2,16%; abnormalitas umumnya didominasi pada bagian ekor 8,52±1,89%. Bentuk abnormalitas bagian kepala didominasi oleh kepala tanpa ekor, kepala melingkar, dan kepala membengkak. Bentuk abnormalitas bagian tengah didominasi oleh bagian tengah melipat, melingkar dan patah. Bentuk abnormalitas bagian ekor didominasi oleh bagian ekor melingkar, membengkok, dan patah. Penggunaan pengecatan eosin nigrosin efektif untuk pengamatan evaluasi morfologi spermatozoa ayam nunukan karena berdasar pada pengamatan mikroskopis menghasilkan kontras antara sel dan background yang baik.