Jamu sebagai obat tradisional banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk mencegah atau mengobati berbagai macam penyakit. Namun, tingginya minat masyarakat terhadap jamu sering dimanfaatkan secara tidak etis oleh produsen dengan menambahkan Bahan Kimia Obat (BKO) untuk meningkatkan penjualan karena diyakini dapat memberikan efek lebih cepat. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis bahan kimia obat pada jamu pegal linu. Analisis kualitatif dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis sedangkan analisis kuantitatif memanfaatkan metode spektrofotometri UV secara simultan. Standar yang digunakan dalam penelitian adalah parasetamol dan asam mefenamat. Fase diam yang digunakan silika GF254 dan fase gerak yang digunakan kloroform : etanol 96% (9:1). Validasi metode analisis melibatkan empat parameter yaitu linieritas, presisi, batas deteksi, dan batas kuantitasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa analisis kualitatif dengan kromatografi lapis tipis mendeteksi keberadaan bahan kimia asam mefenamat di semua sampel dan sampel C, D, I, dan J mengandung bahan kimia parasetamol, sedangkan analisis kuantitatif dengan spektrofotometri UV simultan menghasilkan parameter validasi seperti linearitas, akurasi, presisi, dan kadar yang memenuhi syarat. Pada penetapan kadar menunjukkan bahwa kadar parasetamol dan asam mefenamat yang tertinggi adalah sampel G yaitu 0,570% b/b dan 0,684% b/b.