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Efectos anti-inflamatorios de las aguas minero-medicinales sulfuradas en condrocitos articulares in vitro

Authors: Elena F Burguera; A Vela Anero; Rosa Meijide-Failde; Francisco Jose Blanco;

Efectos anti-inflamatorios de las aguas minero-medicinales sulfuradas en condrocitos articulares in vitro

Abstract

El agua minero-medicinal sulfurada (AMS) es una fuente natural de sulfuro de hidrogeno (H2S). Esta molecula esta ganando reconocimiento como agente antiinflamatorio en modelos in vitro de artrosis (OA) [1]. En este trabajo se evaluaron los efectos de AMS recogida de un manantial publico en la provincia de Pontevedra, Espana, sobre condrocitos articulares de cartilago OA y la linea celular de condrocitos T/C-28a2. Los parametros evaluados fueron la viabilidad de las celulas, la produccion de oxido nitrico (NO) y la expresion genica de diversos mediadores de inflamacion, en concreto, sintasa inducible de NO (iNOS), interleuquina 6 (IL6) y metaloproteinasa 13 (MMP13). Ademas, se estudio la abundancia proteica de iNOS y los niveles de MMP13 en los sobrenadantes celulares. Las celulas se estimularon directamente con el AMS con y sin IL1 (5 ng/mL). Para ello el medio de cultivo celular se preparo disolviendo medio minimo esencial de Dulbecco (DMEM) en polvo en agua destilada (AD) o AMS, que posteriormente se mezclaron en distintas proporciones (25%, 50% y 75% de AMS). Para comprobar la citocompatibilidad de los medios preparados se utilizo un test de viabilidad con el reactivo alamarBlue® y la linea celular. En el resto de los experimentos se utilizaron condrocitos humanos primarios. Las celulas se coestimularon con IL1 (5 ng/mL) y los medios preparados con distintas proporciones de AMS. La produccion de NO se cuantifico utilizando la reaccion de Griess y la expresion genica de los marcadores de inflamacion se determino mediante qRTPCR. Para la determinar la abundancia proteica se utilizo, en el caso de iNOS una inmunocitoquimica y en el caso de la MMP13 un ELISA. El test de viabilidad permitio comprobar que ninguna de las proporciones de AMS utilizadas provocaba un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Mediante microscopia optica y de manera cualitativa se observo como las celulas perdieron su morfologia habitual in vitro al estimularlas con IL1 y como las proporciones crecientes de AMS contrarrestaron este efecto. Con 100% AMS se habia recuperado la morfologia normal. La estimulacion con IL1 tambien provoco un aumento tanto en la produccion de NO, como de la expresion genica y la abundancia proteica de su enzima inducible. Todos estos efectos fueron parcialmente contrarrestados por el AMS, siendo 75% y 100% las proporciones con mejores resultados. La expresion de IL6 tambien se redujo debido a la presencia del AMS. Respecto a los niveles de MMP13 en los sobrenadantes celulares, se observo una tendencia descendente al aumentar la proporcion de AMS, mientras que su expresion genica unicamente se redujo al utilizar el medio preparado con 100% AMS. Los presentes resultados demuestran que el agua mineromedicinal sulfurada utilizada en este trabajo puede ejercer efectos antioxidantes y antiinflamatorios en condrocitos humanos OA cuando se utiliza como medio de cultivo. Estos resultados proporcionan evidencias adicionales sobre el potencial terapeutico del sulfuro de hidrogeno en la artrosis, que se suman a los obtenidos previamente utilizando compuestos sinteticos sulfurados [2].

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