Las nanopartículas de plata (NPs-Ag) son de gran interés debido a las aplicaciones potenciales en diferentes áreas. En busca de metodologías que no presenten riesgos a la salud y sean amigables con el ambiente, la biosíntesis de nanopartículas ha sido una opción viable. Se sabe que diversas biomoléculas presentes en los microrganismos pueden tener las funciones de agente oxidante, reductor y estabilizador, favoreciendo la formación de nanopartículas. En el presente trabajo se tuvo como objetivo la biosíntesis, caracterización y evaluación de la actividad antibacteriana de NPs-Ag. La biosíntesis se realizó a partir de sobrenadante de un cultivo de Pseudomonas aeruginosa, las nanopartículas se caracterizaron mediante espectroscopía UV-VIS, microscopía electrónica de barrido y difracción de rayos X, y la actividad antibacteriana se evaluó con ensayos de dilución en caldo Mueller Hinton, se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) sobre bacterias Gram positivas y negativas. Se encontró que la mejor síntesis fue con una mezcla de 20% de sobrenadante conteniendo 3 mM de AgNO3, observando nanoestructuras con morfologías mixtas. Presentaron actividad contra bacterias Gram positivas y negativas con CMI de 1 a 2 µg/ml y CMB de 2 a 4 µg/ml. En conclusión, el sobrenadante de cultivos de P. aeruginosa es una alternativa viable para la síntesis de NPs-Ag con actividad antibacteriana.