Proses hidrolisis bahan berselulosa tinggi memerlukan perlakuan pendahuluan untuk memisahkan lignin dan hemiselulosa dari selulosa, tetapi proses ini kurang efisien dan tidak ramah lingkungan. Enzim selulase adalah alternatif untuk menghidrolisa selulosa karena sifat kerja enzim yang spesifik dan tidak menghasilkan limbah yang berbahaya serta diharapkan mampu membantu memudahkan proses perlakuan pendahuluan. Bakteri selulolitik penghasil enzim selulase dapat diisolasi dari limbah pertanian yang banyak mengandung selulosa seperti limbah padat tapioka (onggok). Hasil penelitian menunjukkan bahwa 2 isolat yaitu TO4 dan TO5 merupakan isolat yang potensial menghasilkan selulase. Enzim selulase dari isolat TO4 dan TO5 memiliki aktivitas optimum pada pH 5 dan suhu 50°C dengan aktivitas enzim selulase sebesar 0,597 U/mg untuk TO4 dan 0,557 U/mg untuk TO5. Hasil uji kemampuan enzim dalam hidrolisis bahan berselulosa tinggi seperti bagas tebu menunjukkan bahwa enzim selulase dari isolat TO4 mampu menghidrolisis selulosa pada bagas tebu sebanyak 15,8% setelah direaksikan selama 120 jam.Kata kunci:Bakteri Selulolitik, Bagas Tebu, Onggok, Selulase, Selulosa