Die archaeale Fortbewegungstruktur, das Archaellum ist ein faszinierendes Hybrid, welches die Funktion einer bakteriellen Flagelle aber die Architektur eines Type IV Pilus (T4P) in sich vereint. Aufgrund seiner rotierenden Eigenschaft ist dieser T4P ein erstaunliches Beispiel der evolutionären Anpassung und stellt eine neue bisher unbekannte Art sich zu bewegen dar. Trotz dem Wissen über die Beweglichkeit einzelner Archaeen von über 20 Jahren, konnte durch das Fehlen genetischer Methoden in Archaeen die genaue Struktur dieser Fortbewegungseinheit sowie die zugehörigen Gene nicht identifiziert werden.. Alle bisher durchgeführten Studien zur physiologischen und genetischen Analyse des Archaellums sind auf wenigen Euryarchaeota Arten beschränkt. In dieser Studie präsentieren wir eine detaillierte, systematische sowie strukturelle Analyse des crenarchaealen Archaellums aus dem thermoacidophilen Sulfolobus acidocaldarius. Das Archaellum von S. acidocaldarius besteht aus nur sieben elementaren Untereinheiten und repräsentiert damit das minimalistischste der bekannten Archaella Systeme. Deletionsanalysen ergaben, dass alle der sieben fla-Gene essentiell für die ordnungsgemäße Assemblierung des Archaellums sind. Ferner waren alle diese fla-Mutanten unbeweglich, wodurch die Funktion der Fla- Proteine für die Motilität bewiesen wurde. Darüber hinaus konnte mit Immunoblot Analyse gezeigt werden, dass die Biosynthese des Archaellum unter nährstofflimitierten Bedingungen induziert wird. Obwohl sich alle sieben fla-Gene hintereinander in einem genomischen Locus befinden, konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedenen Transkriptionseinheiten exprimiert werden. So werden das Archaellin FlaB und die restlichen Komponenten FlaBXHGFHIJ separat synthetisiert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit fokussierte sich auf die strukturelle Analyse des Archaellums von S. acidocaldarius. So wurden detaillierte biochemische und strukturelle Charakterisierungen der beiden cytoplasmatischen Komponenten des Archaellums, die RecA Proteine FlaH und der ATPase FlaI durchgeführt. Durch die Aufklärung des Interaktionsnetzwerks von FlaH, FlaXund FlaI, konnten wir diese Proteine als strukturelle Komponenten des basalen Körper zusammen mit FlaJ identifizieren. Aufgrund dieser biochemischen Analysen konnte ein Model der Archaellum Assemblierung entwickelt werden, in dem das Transmembranprotein FlaJ als Montageplattform dient, welches die ATPase FlaI zur Membran rekrutiert. Dieser FlaI/FalJ Komplex wird von FlaX in Form einer riesigen Ringstrukturen umgeben, welche direkt mit FlaI interagiert. Aufgrund von Affinitätsstudien von FlaH mit FlaX und FlaI konnte die Bindung zu den beiden Strukturproteinen nachgewiesen werden.. Aufgereinigte ATPase FlaI konnte erfolgreich kristallisiert werden, wodurch seine hexamere Struktur mit einer Auflösung von 2,0 Å aufgeklärt werden konnte. Die Hexamere von FlaI bilden eine kronenartige Struktur, dessen Untereinheiten sich in drei verschiedenen Konformationen befinden können und in einer seltenen Queruntereinheit Interactions Weise zusammengebaut sind. Durch Deletionsstudien konnte weiter gezeigt werden, dass FlaI die erzeugte Energie sowohl für die Assemblierung des Archaellums so wie auch für dessen Rotation bereitstellt. Durch die Deletion der ersten 29 Aminosäuren des N-Terminus von FlaI konnte das Filament noch zusammengebaut, allerdings nicht mehr rotiert werden. In vivo und in vitro Analyse von FlaH zeigten, dass FlaH ein gut konserviertes Walker A allerdings nur ein unvollständiges Walker-B-Motiv hat, beide Motive sind wichtig für die ATP-Bindung und Hydrolyse. Da keine ATPase-Aktivität festgestellt werden konnte, wurde FlaH als ein ATP-bindendes Protein gekennzeichnet Die Kristallstruktur von FlaH konnte mit 2,3 Å auflöst werden. Diese Kristallstruktur enthielt ein gebundenes ATP-Molekül, wodurch zusätzlich bestätigt wurde, dass FlaH ATP nicht hydrolysieren kann. Strukturelle Ähnlichkeiten mit der CII-Domäne von KaiC suggerierten, dass FlaH ein Phosphorylierung abhängiger Regulator für die Assemblierung und Funktion des Archaellums sein kann. Dieser Verdacht wird weiter durch die Auto-Phosphorylierungs Aktivität von FlaH verstärkt. Zusammenfassend, geben die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse neue Einblicke in die genomische Organisation und einzigartige molekulare Architektur des Archaellums von S. acidocaldarius. Außerdem konnten durch die hier dargestellte Strukturanalysen, Unterschiede zwischen den Motorproteinen des Archaellums und des bakteriellen Flagellums, aufgezeigt werden.

The archaeal motility structure, the archaellum is an intriguing hybrid of the function and architecture of two distinct motility organelles, the bacterial flagellum and the T4P, respectively. This rotating T4P is an astonishing example of evolutionary adaptation and represents indeed a unique, third way to move. This microbial structure was however for long time ignored and while many bacterial structures have been already well characterized, the knowledge about the archaellum remains still scare. The so far performed studies were restricted to motility in Euryarchaeota and included physiological and genetic analyses of few species. Here we present a detailed systematic and structural analysis of the crenarchaeal archaellum using the thermoacidophile Sulfolobus acidocaldarius as model organism. S. acidocaldarius has the most minimalistic known archaellum system, composed of only seven Fla proteins. In-frame deletion strain analysis revealed all seven fla genes to be essential for proper archaellum assembly. All these mutants were non-motile, conclusively linking the archaellum of Crenarchaeota with their swimming motility. Moreover, using immunoblot analysis we found the archaella biosynthesis to be induced under nutrient depleting conditions. We could also demonstrate that despite that all the seven fla genes are clustered in one genomic locus, they are expressed in two different transcriptional units. Thus the archaellin FlaB and the remaining structural components FlaXHGFHIJ encoding genes are expressed separately. The main focus of this work was however the structural aspect of the S. acidocaldarius archaellum. Thus we are presenting here a detailed biochemical and structural characterization of the two cytosolic components of the archaellum: the RecA family protein FlaH and the ATPase FlaI. By elucidating the interaction network of FlaH and FlaI within the archaellum, we could place them together with FlaX and FlaJ as structural components of the basal body The ATPase FlaI was successfully crystallized in hexameric form and we could solve this structure at 2.0 Å resolution. FlaI hexamer forms a crown-like structure with subunits at three different conformational states, assembled together in a rare cross-subunit interacting fashion. Further analysis revealed also that the enzymatic activity and system specificity of FlaI are structurally separated, since the ATPase is restricted to the C-terminal domain, while the functional part is represented by the N-terminal domain. We demonstrated moreover that FlaI has a dual role and is involved in generating the energy necessary for both, the archaellum assembly and its rotation. The functions of FlaI could be uncoupled by deleting the first 29 amino acids of the N-terminus, resulting in archaellated, but not motile phenotype. FlaH was characterized as an ATP-binding protein, since no ATPase activity could be detected. It has a well conserved Walker A, but an incomplete Walker B motif and as we could show with in vivo and in vitro analysis both motifs are important for ATP binding and also were essential for archaella assembly and motility. The structure of FlaH was solved at 2.3 Å resolution, revealing the presence of a bound ATP molecule, supporting the hypothesis that FlaH does not hydrolyze ATP. Structural similarities to the CII domain of KaiC and a proved auto-phosphorylation activity, suggest that FlaH plays a regulatory role and controls the archaellum assembly/function in a phosphorylation dependent manner. Taking together, all the presented here data provide insights into the role of the archaellum of S. acidocaldarius, its genomic organization and unique molecular architecture. Furthermore our structural analysis revealed differences between the motor proteins within the archaellum and the related bacterial systems, elucidating the phenomenon of the rotating type IV pilus. However, many questions regarding the archaellum remain still open and present a challenge for further motility studies in Archaea.