Das Plasmamembranlipid Phosphatidylinositol(4,5)biphosphat (PIP2) ist an der Regulation einer Vielzahl zellularer Prozesse beteiligt. Die Dynamik der PIP2-Konzentration in lebenden Zellen in ihrer nativen Umgebung ist bislang allerdings weitgehend unerforscht. Die Kenntnis der PIP2-Dynamik in nativen Zellen ist jedoch eine wesentliche Voraussetzung, um die physiologische Funktion von PIP2 verstehen zu konnen. Seit wenigen Jahren ermoglicht die Entwicklung von PIP2-Sensoren aus PIP2-bindenden Domanen und fluoreszierenden Proteinen die optische Messung der PIP2-Dynamik in lebenden Zellen. In heterologen Expressionssystemen und isolierten Neuronen ist bereits gezeigt worden, dass die Aktivierung von Gq-gekoppelten Rezeptoren die Konzentration von PIP2 in der Plasmamembran reduzieren kann. Diese Reduktion fuhrt zu einer Verminderung von Lipid-Proteininteraktionen und als Konsequenz zu einer Modulation der Aktivitat oder Lokalisation PIP2-abhangiger Proteine (Effektoren). In Neuronen fuhrt diese Depletion von PIP2 nach derzeitigen Modellvorstellungen u.a. zur Regulation verschiedener Ionenkanale und damit zu einer Modulation der elektrischen Erregbarkeit der Zellen. In dieser Arbeit habe ich mit Hilfe konfokaler Mikroskopie der PIP2-abhangigen Membranlokalisation der Tubby-Domane die Gq-induzierte PIP2-Dynamik in situ in hippocampalen CA1-Pyramidenneuronen in akuten Hirnschnitten charakterisiert. Vergleichende Messungen der Translokation der PIP2- und potentiell IP3-sensitiven PLCƒÂ1-PH-Domane zeigten einen ahnlichen Verlauf im Vergleich zu Tubby, wiesen aber insbesondere bei starken Translokationen eine langsamere Regeneration auf. Pharmakologische Aktivierung Gq-gekoppelter muskarinischer Acetylcholinrezeptoren (mAchR) und metabotroper Glutamatrezeptoren (mGluR) fuhrten zur robusten PIP2-Depletion. Die Amplitude der mAchR-induzierten PIP2-Depletion war signifikant groser als die der Typ-I mGluR-induzierten Depletion. Der Unterschied zwischen den Amplituden war in dem apikalen Hauptdendriten starker ausgepragt als im Soma. Bei beiden Rezeptoren zeigte die PIP2-Dynamik im Mittel einen phasisch-tonischen Verlauf. Die Desensitisierung der PIP2-Depletion war bei Aktivierung von mAchR starker ausgepragt. Daruber hinaus zeigen die Daten erstmals, dass die Aktivierung Gq-gekoppelter Rezeptoren auch eine Oszillation der PIP2-Konzentration in der Plasmamembran bewirken kann. Die mAchR- und mGluRI-induzierten Oszillationen zeigen auserdem, das Neurone zu einer rapiden PIP2-Regeneration wahrend andauernder Anwesenheit der Agonisten fahig sind. Die Applikation von Agonisten weiterer Gƒ¿q-gekoppelter Rezeptoren induzierte im Soma und apikalen Hauptdendriten keine PIP2-Dynamik. Insgesamt unterstutzen die Daten eine physiologische Funktion der PIP2-Dynamik in Neuronen und korrelieren gut mit dem allgemeinen Verlauf von elektrophysiologischen Antworten der Zellen auf die Agonisten. Eine physiologische Funktion der PIP2-Dynamik wird weiter von Ergebnissen aus elektrischen Stimulationen im Bereich afferenter Fasern im Str. oriens unterstutzt. Die Daten deuten auf eine synaptisch induzierbare PIP2-Depletion hin, die Pharmakologie der Effekte muss aber noch naher untersucht werden. Wie Daten aus Gyrus dentatus Kornerzellen zeigen, ist die Gq-induzierte PIP2-Dynamik nicht nur rezeptor-, sondern auch neuronentypspezifisch, denn hier induzierten mAchR- und mGluR-Agonisten keine messbare PIP2-Depletion.

The membrane lipid phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PIP2) regulates many cellular processes. Yet the dynamics of PIP2 concentration changes in living cells in their native environment are virtually unknown. However, knowledge of these dynamics is prerequisite to understanding the physiological functions of PIP2. Recent development of PIP2-probes made of PIP2-binding domains and fluorescent proteins has enabled optical measurements of PIP2 dynamics in living cells. Previous studies in heterologous expression systems and isolated neurons showed that activation of Gáq coupled receptors can deplete the PIP2 content in the plasma membrane. This PIP2 reduction results in a decrease of lipid-protein interactions and consequently to a modulation of the activity and localization of PIP2-sensitive proteins (effectors). In neurons, PIP2 depletion is thought to modulate various ion channels and thus electric excitability. In this study, I have characterized the Gq-induced PIP2 depletion in CA1 hippocampal neurons in situ in acute brain slices. Measurement of PIP2 dynamics was achieved by means of confocal microscopy of PIP2 dependent membrane association of the tubby domain. Comparative measurements of PIP2- and potentially IP3-sensitive PLCd1-PH domain translocation largely resembled the tubby data but showed a slower recovery especially upon strong translocation. Pharmacological activation of both muscarinic acetylcholine (mAch) and metabotropic glutamate (mGlu) receptors (R) induced a robust depletion of PIP2. The amplitude of mAchR induced PIP2 depletion was significantly larger compared to mGluR (type I). This difference in amplitudes was more pronounced in the main apical dendrite compared to the soma. The average time course of PIP2 dynamics was similar for both receptors and showed an initial peak and a lower plateau phase, revealing desensitization. The phasic-tonic time course according to desensitization was more pronounced for mAchR activation. Furthermore, the data obtained here show for the first time that in some neurons Gáq coupled receptor activation induces oscillations of membrane PIP2 concentrations. Moreover, oscillations demonstrate that neurons can rapidly recover PIP2 during prolonged presence of agonists. Application of other Gq coupled receptor agonists did not induce a measureable PIP2 depletion in soma and main apical dendrite. Taken together the results support a physiological function of PIP2 dynamics and correlate well with the general time course of electrophysiological responses to the agonists. A physiological role of PIP2-dynamics is further supported by results of electric stimulation in the area of afferent fibers in the stratum oriens. The data implicate that PIP2 depletion can be induced by synaptic receptor activation, but the pharmacology needs further verification. Data from dentate gyrus granule cells show that PIP2 depletion is not only a receptor but also neurontype specific process, as application of mAchR and mGluR agonists did not induce a measureable PIP2-depletion here.