Eine unter Bakterien weit verbreitete Anpassungsstrategie an hyperosmotische Umgebungsbedingungen ist die Aufnahme oder die Synthese von osmotisch wirksamen Substanzen, die sogenannten kompatiblen Solute. In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Aspekte aus dem Bereich der Synthese von den sogenannten kompatiblen Soluten aufgeklärt. Ein häufig genutztes kompatibles Solut in Bakterien ist das Tetrahydropyrimidinderivat Ectoin. Dieses kompatible Solut kann in einem weiteren enzymatischen Schritt durch eine Ectoin-Hydroxylase EctD zu Hydroxyectoin hydroxyliert werden. Um diese Hydroxylierungsreaktion besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit durch Röntgenstrukturanalysen die Kristallstruktur der Ectoin-Hydroxylase EctD aus V. salexigens in Zusammenarbeit mit der AG von Prof. Dr. K. Reuter (Universität Marburg) aufgeklärt. Die Ergebnisse aus der Kristallstruktur von EctD mit gebundenem Eisen, ein Vergleich des aktiven Zentrums der EctD Struktur mit Ectoin bindenden Substratproteinen aus Ectoin Transportern sowie der bioinformatische Vergleich von putativen EctD Proteinsequenzen führten zu einer Auswahl an Aminosäuren, die für eine Mutagenesestudie herangezogen wurden. Die Ergebnisse der Mutagenesestudie von hoch-konservierten Aminosäuren lieferten wichtige Informationen über deren Funktion und über den möglichen Synthesemechanismus des EctD Enzyms. Da man jedoch keine EctD Struktur mit gebundenem Substrat Ectoin oder Co-Substrat 2-Oxoglutarat erhalten konnte, wurden weitere potentielle Ectoin-Hydroxylasen aus verschiedenen Mikroorganismen kloniert und affinitätschromatographisch gereinigt. Alle gereinigten Ectoin-Hydroxylasen aus den Bakterien Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10, Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi, Acidiphilium cryptum und Halomonas elongata sowie dem Crenarchaeon N. maritimus waren enzymatisch aktiv. Dazu wurden die genauen Essaybedingungen jeder Ectoin-Hydroxylase in Bezug auf pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration angepasst und optimiert. Danach erfolgte die enzymatische Charakterisierung und die Ermittlung der biochemischen Parameter wie Km, vmax und kcat. Durch weitere bioinformatische Analysen der ect Gene, die überwiegend als ein geschlossenes Gencluster in den Organismen organisiert sind, wurden weitere interessante Gene innerhalb des ect-Genclusters identifiziert. Dabei trat immer wieder ein für eine Aspartokinase kodierendes ask Gen auf. Die Aspartokinasen synthetisieren aus L-Aspartat den für die Ectoin Synthese wichtigen Vorläufer β-Aspartat-Semialdehyd im Zusammenschluss mit einem Asd Enzym. Im Genom des Bakteriums Pseudomonas stutzeri A1501 wurden zwei Gene für potentielle Aspartokinasen gefunden. Ein Gen befindet sich im ect-Gencluster und das zweite ask Gen ist an anderer Stelle im Genom lokalisiert. Die beiden Gene der Aspartokinasen wurden kloniert, die Proteine heterolog in E. coli produziert und durch enzymatische Tests charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten wichtige Unterschiede im Hinblick auf die Eigenschaften der beiden studierten Aspartokinasen in diesem Bakterium. In Wachstumsanalysen mit dem Actinomyceten Streptomyces coelicolor A3(2) wurde die physiologische Bedeutung der beiden kompatiblen Solute Ectoin und Hydroxyectoin untersucht. S. coelicolor wird durch Ectoin und Hydroxyectoin unter hohen osmotischen Bedingungen und hohen Temperaturen protektiert. Es konnte gezeigt werden, dass beim Einsatz eines 1:1 Gemischs von Ectoin und Hydroxyectoin diese Protektion am effektivsten ist. Des Weiteren wurde durch Transportstudien mit radioaktiv markiertem [14C]-Ectoin untersucht, bei welcher Salinität und bei welcher Temperatur die Aufnahme der kompatiblen Solute in S. coelicolor induziert wird. Durch die Kombination der beiden Stressfaktoren wie Hochsalz und hohe Temperatur, konnte gezeigt werden, dass in dieser Situation die Aufnahme am stärksten angeschaltet wird.

A common strategy of bacteria to adapt to hypo osmotic environmental conditions is the uptake or synthesis of osmotic active substances, referred to as compatible solutes. This thesis deals mainly with aspects based on the synthesis of those compatible solutes. A commonly used compatible solute in bacteria is the tetrahydropyrimidine derivative ectoine, which can be converted enzymatically into the hydroxylated form hydroxyectoine by the ectoine hydroxylase EctD. In order to understand the hydroxylation reaction in more detail, x-ray structure analysis were used to analyze the crystal structure of the ectoine hydroxylase EctD from V. salexigens in cooperation with the working group of Prof. Dr. K. Reuter (University Marburg). With the intention to select amino acids for mutagenesis studies, three approaches were used: 1) the EctD crystal structure in complex with Fe3+, 2) a comparative analysis of the active site of the EctD structure with putative ectoine binding proteins from ectoine transporters and 3) bioinformatics comparison of putative EctD protein sequences. Results from those mutagenesis studies of highly conserved amino acid revealed important information about their function and the possible synthesis mechanism of EctD enzyme. As we were not able to crystallize EctD in a complex with its substrate ectoine or its co-substrate 2-oxoglutarate, putative ectoine hydroxylases from a variety of microorganisms were cloned and purified via affinity chromatography for further crystallization studies. All purified ectoine hydroxylases from the bacteria Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10, Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi, Acidiphilium cryptum and Halomonas elongata as well as from the crenarchaeon N. maritimus were enzymatically active. The activity of each enzyme and their biochemical parameters like Km, vmax and kcat were measured after optimization of the assay conditions regarding pH value, temperature and salt concentration. Additional bioinformatics of ect genes, which are mainly organized in gene clusters, showed interesting genes inside those gene clusters. Continually a ask gene encoding for an aspartokinase was identified. Aspartokinases synthesize the essential precursor for ectoine synthesis β-aspartate-semialdehyde from L-aspartate in cooperation with the Asd enzyme. The genome of Pseudomonas stutzeri A1501 contains two genes encoding for putative aspartokinases. Whereas one of those genes is located in the ect gene cluster, the other gene is found at another position in the genome. Both genes were cloned, the proteins were heterologously produced in E. coli and characterized by enzymatic approaches. Those analyses show important difference in features between both aspartokinases. The physiological role of both competitive solutes ectoine and hydroxyectoine was investigated using growth studies with the actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Ectoine and hydroxyectoine protects S. coelicolor from the effects of high osmotic conditions and high temperatures. Thereby, the mixture of ectoine und hydroxyectoine in a 1:1 ratio leads to the most efficient protection. In order to investigate the initiation of the uptake of competitive solutes by S. coelicolor at a certain degree of salinity and temperature, transport studies with radioactive labeled [14C]-ectoine were used. The combination of both stress factors, high salt and high temperature, leads to the highest uptake of competitive solutes in the cell.