Neurotrophe Faktoren ermöglichen das Überleben von Neuronen auch unter pathologischen Stressbedingungen sowie eine erneute Proliferation neuronaler Zellstrukturen nach Beschädigung. Neurotrophe Faktoren sind definiert als sekretierte Proteine. Sie werden nach Strukturhomologien, Rezeptoren und Signaltransduktionswegen in verschiedene Familien unterteilt. Die Bezeichnung „neurotropher Faktor“ umfasst Proteine mit unterschiedlichsten Funktionen. Die neurotrophen Eigenschaften von CDNF, das zur CDNF/MANF Proteinfamilie gehört, wurden durch intrastriatale Injektion und darauf folgende Protektion und Proliferation von Neuronen in einem in vivo Schädigungsmodell nachgewiesen. Diese Proteinfamilie könnte somit einen neuen Ansatz zu einer Therapiemöglichkeit von neurodegenerativen Krankheiten bieten. CDNF und MANF haben ein Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa. Der Aminoterminus enthält eine globuläre Saposin-ähnliche (saposin like protein SAPLIP)-Domäne, und der Carboxyterminus ist verwandt mit der Sequenz von scaffold attachment factors (SAFs) und enthält analog zu SAFs eine redoxaktive Cysteinbrücke eingebettet in ein CXXC-Motiv. Die biologische Funktion, Rezeptoren und Wirkmechanismus der Neuroprotektion der CDNF/MANF Proteinfamilie sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Versuche zur Charakterisierung der Eigenschaften von CDNF und dessen SAPLIP-Domäne unternommen. Für alle Versuche waren umfangreiche biotechnologische Vorarbeiten notwendig, die in der Forschungsabteilung von CSL Behring, Marburg vorgenommen wurden. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der These, dass CDNF, ausgehend von seiner SAPLIP-Domäne, transduktorische Eigenschaften besitzen könnte: Makromoleküle in Zellen zu schleusen, ist durch die selektiv durchlässige Zellmembran nur sehr beschränkt möglich. Diese Restriktionen erlauben nur einem sehr kleinen Teil möglicher therapeutischer Substanzen den Zugang ins Zellinnere. Die natürliche Struktur von beispielsweise Proteinen verhindert das passive Eindringen dieser Stoffe in die Zelle. In den 1980er Jahren wurden jedoch Peptidsequenzen entdeckt, die als Molekültransporter Makromoleküle in das Zellinnere schleusen können. Die N-terminalen Domäne von CDNF besitzt nicht die klassische Struktur proteinogener Molekültransporter, sie ist jedoch verwandt mit Saposinen. Saposine und Saposin-ähnliche Domänen weiterer Proteine können Lipide binden oder Zellmembranen permeabilisieren. Diese Eigenschaften führten zu der These, dass auch die SAPLIP-Domäne von CDNF potentielle transduktorische Funktionen ausüben könnte. Zur Überprüfung der These wurden CDNF-Fusionsproteine biotechnologisch produziert und auf ihre transduktorischen Eigenschaften untersucht. Es konnte aber keine Transduktion von CDNF oder Assoziation mit der Zellmembran detektiert werden. Der zweite Teil der Arbeit zeigt die zelluläre Lokalisation von nativem CDNF. CDNF wird als sekretierter neurotropher Faktor beschrieben. Die C-terminale KTEL-Sequenz von CDNF weist jedoch eine große Ähnlichkeit zum allgemeinen ER-Retentionssignal KDEL auf. Wir zeigen in dieser Arbeit mit unterschiedlichen Methoden zum ersten Mal, dass CDNF tatsächlich im ER retardiert wird. Es wurden weiterhin CDNF-Mutanten mit verändertem CTerminus produziert. Die CDNF-Mutante mit C-terminaler KDEL-Sequenz und natives CDNF konnten nicht im Überstand von transfizierten Säugetier-Zellkulturen detektiert werden. Im Gegensatz zu CDNF-Mutanten mit deletiertem, maskiertem oder anderweitig verändertem C-Terminus, die im Kulturüberstand nachweisbar waren. Dieser Vergleich mit unterschiedlichen CDNF-Mutanten zeigt die wichtige Funktion einer freien C-terminalen KTEL-Sequenz bei der zellulären Lokalisation von CDNF. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den neurotrophen Eigenschaften von CDNF in vitro. Nach erfolgreicher Protektion sollte durch molekulare und biochemische Methoden der unbekannte Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von CDNF näher untersucht werden. Verschiedene neuronale Zellkulturen wurden dafür mit 6-Hydroxydopamin oder Glutamat geschädigt. Rekombinant hergestelltes CDNF oder dessen SAPLIP-Domäne wurden extern zugeführt und der Einfluss der zugesetzten Proteine analysiert. Im Gegensatz zu den vorherigen Ergebnissen in vivo, konnte in keinem der verwendeten in vitro Systeme eine signifikante Protektion oder Proliferation durch CDNF beobachtet werden.

Neurotophic factors enable the survival of neurons under pathological conditions and mediate novel proliferation of damaged neuronal cell structures. Neurotrophic factors are defined as secretory proteins. They are clustered into families according to structural similarities, receptors and signal transduction pathways. These neurotrophic protein families contain proteins of diverse functions. The neurotrophic abilities of CDNF - a member of the CDNF/MANF family - first have been discovered in vivo. Protection and proliferation of neurons were observed after intrastriatal application of CDNF in a rat model of neuronal degeneration. This protein family could therefore lead to a new concept in the therapy of neurodegenerative diseases. CDNF and MANF have a molecular weight of around 21 kDa. The amino terminus is formed by a globular saposin-like protein (SAPLIP) domain, whereas the carboxy terminus is related to scaffold attachment factors (SAF) and also contains a redox-active cysteine bridge presented in a CXXC motif. The biological function, receptors and molecular mechanisms involved in the neurotrophic effect are hence unknown. This work presents a set of experiments to characterize the properties of CDNF and its SAPLIP domain. The extensive biotechnological work of the performed experiments was conducted at CSL Behring, Marburg. The first part of this thesis investigates a proposed theory that the SAPLIP domain of CDNF could initiate a transduction effect. Due to their size and natural structure macromolecules are not able to pass cell membranes passively. Therefore only a few therapeutical substances have easy access to the interior of cells. In the 1980’s a special class of transporter peptides was discovered that can pass the cell membrane together with attached macromolecules. The Nterminal domain of CDNF does not contain the typical structure of these cell membranepenetrating peptides but it is related to saposins. Saposins and saposin-like domains of other proteins can bind lipids (e.g. for degradation in lysosomes) or even permeabilize cell membranes. These abilities lead to the proposal of the potential transduction effect of the SAPLIP domain of CDNF. CDNF fusion proteins were designed and produced biotechnologically to investigate the transduction effect of the SAPLIP domain. However, no transduction effect or association of CDNF with cell membranes could be detected. The second part shows the cellular localization of native CDNF which has been described as a secretory neurotrophic factor. Interestingly, the C-terminal KTEL sequence of CDNF is similar to the general ER retention sequence KDEL. We could show for the first time with different experimental methods that CDNF is retarded in the ER. Different CDNF mutants were designed to proof the importance of the KTEL retention signal. The CDNF mutant with the general ER retention sequence KDEL and native CDNF could not be detected in the supernatant of confluent cell cultures. In contrast, CDNF mutants with deleted, masked or otherwise altered C-terminus could be discovered in the medium as secreted proteins. This shows the importance of a free C-terminal KTEL sequence to investigate native CDNF localization and trafficking. The third part of the thesis was designed to endeavour the neurotrophic mechanisms of CDNF in vitro. Putative neuroprotective effects should be further investigated by molecular and biochemical methods. Different neuronal cell cultures were damaged by 4-hydroxydopamin or glutamate. Recombinant CDNF or the isolated SAPLIP domain were externally administered to investigate the protective effect of these proteins. In contrast to the formerly discovered protective effect in vivo no protective or proliferative effects of CDNF were observed in vitro.