Utilizaram-se 25 ejaculados de cinco garanhões da raça Mangalarga Marchador, para avaliar dois protocolos de congelamento. No primeiro tratamento, resfriou-se o sêmen até 5ºC (curva de resfriamento - CR) antes do congelamento, no segundo, congelou-se o sêmen sem resfriamento (SC). Compararam-se duas formas de descongelamento, a 37ºC e a 75ºC/sete segundos. Os protocolos foram avaliados pelo teste de termo resistência (TTR - motilidade total e vigor) e pela funcionalidade da membrana plasmática (teste hiposmótico e eosina nigrosina). A motilidade total no tempo zero do TTR foi melhor (P<0,05) para o sêmen do tratamento CR, quando comparado com o do SC, em ambas as temperaturas de descongelamento, respectivamente, 46,7% e 21,0% (descongelamento a 37ºC), e 44,2% e 24,6% (descongelamento a 75ºC). Na mesma ordem, o número de espermatozóides vivos foi maior (P<0,05) no tratamento CR, 71,0% e 54,6% (descongelamento a 37ºC), e 77,4% e 54,1% (descongelamento a 75ºC). O sêmen do tratamento CR apresentou maior reação (P<0,05) ao teste hiposmótico e maior vigor (P<0,05) que o do SC. O sêmen descongelado a 75ºC apresentou melhor vigor (P<0,05) que o descongelado a 37ºC, independentemente do protocolo de congelamento. Os resultados mostraram, in vitro, o efeito benéfico do resfriamento do sêmen antes do congelamento.