Die stetige Zunahme antimikrobieller Resistenzen stellt eine erhebliche globale Bedrohung dar. Aufgrund dessen sind antimikrobielle Peptide als Alternative zu traditionellen Antibiotika in den Fokus der Pharmaindustrie gerückt. NK2-ALK, ein Derivat des antimikrobiellen Peptids NK-Lysin, zeigt eine hohe Aktivität gegenüber einem breiten Spektrum von Bakterien sowie Krebszellen. Die geringe Größe und der amphipathische Charakter erschweren die herkömmliche rekombinante Produktion dieser Peptide, gleichzeitig ist die chemische Synthese häufig unwirtschaftlich. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Expression und Aufreinigung von NK2-ALK in zwei verschiedenen Expressionssystemen, E. coli und P. pastoris (syn. Komagataella phaffii), zu untersuchen und im Anschluss zu analysieren, inwieweit die antimikrobielle Aktivität mit der chemisch synthetisierter Peptide vergleichbar ist. In E. coli dient eine Onconase-Variante (ONC-DCless) als Fusionspartner. Aufgrund der molekularen Eigenschaften präzipitiert das Fusionskonstrukt in Einschlusskörpern. Im Fall von P. pastoris wurde ein modifiziertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) als Fusionspartner gewählt. Die Fusionsproteinsequenz wurde homolog in den pAOX1-Locus des P. pastoris-Genoms rekombiniert. Die unterschiedlichen Fusionsproteine wurden in einem Bioreaktor im Labormaßstab exprimiert und durch eine Ni2+- Chelat Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die antibakterielle Aktivität des gespaltenen NK2-ALK wurde gegen E. coli WBB01 mittels eines Agardiffusionstests untersucht. Die erfolgreiche Expression und Aufreinigung des Fusionsproteins kann mittels SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse bestätigt werden. Die unlösliche Expression des Peptids lieferte eine hohe Ausbeute, etwa 27 mg Fusionsprodukt pro Gramm Biotrockenmasse konnten gewonnen werden. Unter optimalen Bedingungen lieferte der P. pastoris-Stamm eine Ausbeute von 45 mg Fusionsprodukt pro Liter Zellbrühe. Die Ergebnisse der antimikrobiellen Tests bestätigten die Produktion von bioaktivem rekombinantem NK2-ALK durch die unterschiedlichen Expressionssysteme. Die Synthese dieses antimikrobiellen Wirkstoffs als Fusionsprotein erleichtert die Produktion und Aufreinigung. Die Ergebnisse zeigen, dass rekombinantes NK2-ALK, das in E. coli oder P. pastoris exprimiert wird, als alternative antibiotische Substanz verwendet werden kann. In diesem Fall war die Produktion in E. coli viel effizienter als in P. pastoris.

The rise of antimicrobial resistance is a significant global threat to human health. Antimicrobial peptides as alternatives to conventional antibiotics have become of interest in the pharmaceutical industry. NK2-ALK, a derivative of the antimicrobial peptide NK-Lysin, displays high activity against a broad range of bacteria as well as cancer cells. However, due to the small size and the amphipathic character of antimicrobial peptides, their conventional recombinant production and purification are often difficult, additionally, the chemical synthesis is uneconomic. The aim of this work was to study the expression and purification of NK2-ALK in two different expressionsystems, E. coli and P. pastoris (syn. Komagataella phaffii), as well as evaluate if its antimicrobial activity is comparable to the chemically synthesized peptide. In E. coli NK2-ALK was expressed fused to an onconase variant. Due to the properties of the fusion partner, the fusion construct preciptes in inclusion bodies. In the case of P. pastoris enhanced green fluorescent protein (eGFP) was chosen as fusion partner. The fusion protein sequence was recombined homologous into the pAOX1 locus of the P. pastoris genome. In both cases the fusion protein was expressed in a labscale bioreactor and purified by Ni2+-chelating affinity chromatography. The antibacterial activity of the cleaved NK2-ALK was tested against E. coli WBB01 by an inhibition zone assay. In both cases SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed the sucessful expression and purification of the fusion protein by showing a band of the expected size. The insoluble expression of the peptide in fusion with ONC-DCless provided high yield, about 27 mg of fusion product per gram dry cell weight. Under optimal conditions the P. pastoris strain grown in a fed-batch mode produced yields of 45 mg fusion product per liter cell broth. Results of antimicrobial tests confirmed production of bioactive recombinant NK2-ALK by E. coli and P. pastoris expression system. The synthesis of this antimicrobial agent as a fusion protein has facilitated production and purification. Results demonstrated that recombinant NK2-ALK expressed in E. coli or P. pastoris could be used as an alternative antibiotic substance. In this case production in E. coli was much more efficient then in P. pastoris.