Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, επιχειρήθηκε η διερεύνηση μοριακών μηχανισμών που αξιοποιούνται από το μύκητα Verticillium dahliae για την εκδήλωση της παθογόνου δράσης του. Προηγούμενες ερευνητικές εργασίες σε φυτοπαθογόνους μύκητες, έχουν αποδείξει ότι τα γονίδια του διαμεμβρανικού υποδοχέα PTH11 (ένας συζευγμένος με G πρωτεΐνες υποδοχέας) και της F-box πρωτεΐνης Frp1 διαδραματίζουν ρόλο, το μεν πρώτο στην αναγνώριση σήματος από το εξωκυττάριο περιβάλλον, το δε δεύτερο στην επαγωγή υδρολυτικών ενζύμων που διασπούν τα κυτταρικά τοιχώματα του φυτού - ξενιστή. Με στόχο τη λειτουργική μελέτη των ομόλογων των ανωτέρω γονιδίων στην παθογένεια του V. dahliae (εφεξής καλούμενων Vpth και Vrp αντίστοιχα), αξιοποιήθηκαν τεχνικές αντίστροφης γενετικής ανάλυσης, με την πραγματοποίηση προσπαθειών απενεργοποίησης αλλά και υπερέκφρασης των γονιδίων στο μύκητα. Η απενεργοποίηση και στις δύο περιπτώσεις επιχειρήθηκε μέσω γονιδιακής αντικατάστασης, τεχνικής η οποία βασίζεται στον ομόλογο ανασυνδυασμό. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν αλληλόμορφοι αντικατάστασης, στους οποίους η αλληλουχία των γονιδίων διακόπτονταν από γονίδια ανθεκτικότητας σε επιλεγμένα αντιβιοτικά, εν προκειμένω υγρομυκίνη Β στην περίπτωση του Vpth και γενετισίνη στην περίπτωση του Vrp. Παράλληλα, κατασκευάστηκαν και κασέτες επανεισδοχής για την αποκατάσταση των ενδογενών γονιδίων στο γονιδίωμα των μεταλλαγμένων στελεχών. Η απενεργοποίηση του γονιδίου Vpth πραγματοποιήθηκε στο άγριο στέλεχος VdLs.17 (μη – αποφυλλωτικός παθότυπος), ωστόσο η απενεργοποίηση του γονιδίου Vrp στα στελέχη 70V (μη – αποφυλλωτικός παθότυπος) και 22V (T9) (αποφυλλωτικός παθότυπος) που δοκιμάστηκε, δεν ήταν επιτυχής. Όσον αφορά στην υπερέκφραση των γονιδίων, αυτή επιχειρήθηκε, στην περίπτωση του Vpth με έμμεσο τρόπο, εισάγοντας την κατασκευή επανενσωμάτωσης του γονιδίου στο γονιδίωμα αγρίων στελεχών, ενώ στην περίπτωση του Vrp μέσω κατασκευής μιας σύντηξης του γονιδίου με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης EGFP, με τη σύντηξη να τίθεται υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή της ριβοσωμικής πρωτεΐνης του Magnaporthe grisea. Και για τα δύο γονίδια τα μεταλλαγμένα στελέχη που αποκτήθηκαν, προέκυψαν από μετασχηματισμό των 70V και 22V (T9) αγρίων στελεχών, μη – αποφυλλωτικού και αποφυλλωτικού παθότυπου αντίστοιχα. Απενεργοποίηση του γονιδίου Vpth περιόρισε τη μυκηλιακή ανάπτυξη, την παραγωγή μικροσκληρωτίων αλλά και την κονιδιοποίηση του μύκητα, ενώ οδήγησε και σε σημαντική μείωση της παθογόνου δράσης του. Εισαγωγή περισσοτέρων ενθεμάτων του Vpth αντίθετα, οδήγησε σε ποικίλο βαθμό αύξησης της έκφρασής του μεταξύ των αποκτηθέντων στελεχών και επέδρασε ποικιλοτρόπως στην παθογένεια. Αντίθετα, υπερέκφραση του γονιδίου Vrp υπό τον έλεγχο ισχυρού υποκινητή, οδήγησε στην απόκτηση μεταλλαγμένων στελεχών με μεγαλύτερη ικανότητα πρόκλησης ασθενείας, συγκριτικά με τα αντίστοιχα άγρια από τα οποία προέκυψαν. Διαφορές παρατηρήθηκαν και ως προς την φαινοτυπική ανάπτυξη αλλά και κονιδιοποίηση των Vrp υπερεκφραζόντων στελεχών, σε υλικά που έφεραν ως πηγή άνθρακα διαφορετικούς μονο- και πολυσακχαρίτες, ενώ η εφαρμογή δοκιμής κατανάλωσης υποστρώματος πηκτίνης υπέδειξε την αυξημένη παραγωγή πηκτινικής λυάσης από τα μεταλλαγμένα στελέχη. Προχωρώντας στο επόμενο σκέλος της εργασίας, επιχειρήθηκε η μελέτη μιας NLP πρωτεΐνης, ονομαζόμενης VdNEP, η παραγωγή της οποίας από το V. dahliae, συμβάλλει στην εκδήλωση των συμπτωμάτων της βερτισιλλίωσης, μέσω της πρόκλησης νέκρωσης και παραγωγής αιθυλενίου. Με απώτερο στόχο, τον εντοπισμό της θέσης δράσης της πρωτεΐνης, κατασκευάστηκε μία σύντηξη του γονιδίου VdNEP με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης EGFP, με όλη την κατασκευή να τίθεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ριβοσωμικής πρωτεΐνης του M. grisea. Η σύντηξη εισήχθη στα άγρια στελέχη 25V (SS4), 70V (μη-αποφυλλωτικός παθότυπος) και 22V (T9) (αποφυλλωτικός παθότυπος), με τα μεταλλαγμένα στελέχη που αποκτήθηκαν να μετασχηματίζονται περαιτέρω με το γονίδιο AsRed της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης. Ακόλουθη μελέτη μικροσκοπίας επέτρεψε τον εντοπισμό σε κυτταρικό επίπεδο αλλά πρωτευόντως σε επίπεδο φυτού - ξενιστή, της έκκρισης και διακίνησης της πρωτεΐνης VdNEP. Παράλληλα, διεξήχθη πείραμα προσδιορισμού της έκφρασης του γονιδίου VdNEP αλλά και των υπολοίπων γονιδίων που εξετάστηκαν σε αυτή τη διατριβή, κατόπιν ανάπτυξης των στελεχών 25V (SS4) και 22V (T9) σε συνθήκες που προσομοίαζαν το αγγειακό σύστημα φυτών ξενιστών. Διαφορές καταγράφηκαν όχι μόνο μεταξύ χρονικών στιγμών αλλά και μεταξύ των στελεχών των διαφορετικών παθοτύπων. Τέλος, μελετήθηκε η πιθανότητα αξιοποίησης του γονιδίου VdNEP ως βάσης για την ανάπτυξη ενός μοριακού δείκτη, ο οποίος θα επιτρέπει τον γρήγορο και αποτελεσματικό εντοπισμό των απομονώσεων του παθογόνου που ανήκουν στον ιδιαίτερα καταστρεπτικό αποφυλλωτικό παθότυπο. Για το σκοπό αυτό, κατόπιν αρχικών αποτελεσμάτων υβριδισμών κατά Southern στους οποίους το VdNEP εντοπίστηκε σε διαφορετικά γενωμικά θραύσματα μεταξύ απομονώσεων των δύο παθοτύπων, επιλέχθηκαν να απομονωθούν μέσω Inverse PCR οι περιοχές που συνορεύουν με το γονίδιο σε ποικίλα στελέχη. Σύγκριση των αλληλουχιών επέτρεψε τον εντοπισμό πολυμορφισμών στην 3΄ αμετάφραστη περιοχή (3΄- UTR) του VdNEP μεταξύ των στελεχών αναφοράς για τον αποφυλλωτικό και μη - αποφυλλωτικό παθότυπο. Βάσει αυτών, σχεδιάστηκαν εκκινητές, οι οποίοι αξιολογήθηκαν στη συνέχεια σε ένα εύρος απομονώσεων ως προς την ικανότητά τους να κατηγοριοποιούν τα στελέχη στους αντίστοιχους παθότυπους. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την καταλληλότητα του νέου μοριακού δείκτη ως αξιόπιστου εργαλείου για την διάκριση απομονώσεων του V. dahliae. Δεδομένου του κρίσιμου ρυθμιστικού ρόλου που διαδραματίζουν οι 3΄ αμετάφραστες περιοχές στην σταθερότητα, στον κυτταρικό εντοπισμό και στην τελική μετάφραση των mRNA, ο εντοπισμός των ανωτέρω πολυμορφισμών υποδεικνύει την πιθανή εμπλοκή του γονιδίου στην εμφάνιση του αποφυλλωτικού φαινότυπου και ανοίγει ένα πεδίο που χρήζει περαιτέρω έρευνας.