Bien que la cyclophiline A (CyP-A) soit une petite immunophiline relativement abondante présente dans le cytoplasme de toutes les cellules de mammifères, sa (ses) fonction(s) générale (s) en l'absence du médicament immunosuppresseur cyclosporine A n'est pas connue. En revanche, les immunophilines de haut poids moléculaire se liant à hsp90 semblent jouer un rôle dans le trafic de protéines dans la mesure où il a été démontré qu'elles relient les complexes des récepteurs glucocorticoïdes hsp90 et p53·hsp90 à la protéine motrice de la dynéine pour un mouvement rétrograde le long des microtubules. Ces immunophilines se lient indirectement à la dynéine cytoplasmique par l'association du domaine de l'immunophiline peptidylprolyl isomérase (PPIase) avec la dynamitine, un composant du complexe dynactine associé à la dynéine (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., Ljungman, M. et Pratt, W. B. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22483-22489). Ici, nous montrons que CyP-A existe dans des hétérocomplexes natifs contenant de la dynéine cytoplasmique qui peut être formée dans des systèmes acellulaires. L'activité de la prolyl isomérase n'est pas nécessaire pour former le complexe de la dynéine, mais le fragment du domaine PPIase de FKBP52 bloque la formation du complexe et CyP-A se lie à la dynamitine d'une manière dépendante du domaine PPIase. Les hétérocomplexes CyP-A contenant de la tubuline et de la dynéine peuvent être formés dans le cytosol préparé dans des conditions de stabilisation des microtubules, et CyP-A se colocalise dans les fibroblastes de souris avec des microtubules. La colocalisation avec les microtubules est perturbée par la surexpression du fragment du domaine PPIase. Ainsi, nous concluons que CyP-A s'associe in vitro et in vivo au complexe dynéine/protéine motrice dynactine et nous suggérons que CyP-A peut remplir une fonction générale liée à la liaison de la cargaison pour un mouvement rétrograde le long des microtubules. Bien que la cyclophiline A (CyP-A) soit une petite immunophiline relativement abondante présente dans le cytoplasme de toutes les cellules de mammifères, sa (ses) fonction(s) générale (s) en l'absence du médicament immunosuppresseur cyclosporine A n'est pas connue. En revanche, les immunophilines de haut poids moléculaire se liant à hsp90 semblent jouer un rôle dans le trafic de protéines dans la mesure où il a été démontré qu'elles relient les complexes des récepteurs glucocorticoïdes hsp90 et p53·hsp90 à la protéine motrice de la dynéine pour un mouvement rétrograde le long des microtubules. Ces immunophilines se lient indirectement à la dynéine cytoplasmique par l'association du domaine de l'immunophiline peptidylprolyl isomérase (PPIase) avec la dynamitine, un composant du complexe dynactine associé à la dynéine (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., Ljungman, M. et Pratt, W. B. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22483-22489). Ici, nous montrons que CyP-A existe dans des hétérocomplexes natifs contenant de la dynéine cytoplasmique qui peut être formée dans des systèmes acellulaires. L'activité de la prolyl isomérase n'est pas nécessaire pour former le complexe de la dynéine, mais le fragment du domaine PPIase de FKBP52 bloque la formation du complexe et CyP-A se lie à la dynamitine d'une manière dépendante du domaine PPIase. Les hétérocomplexes CyP-A contenant de la tubuline et de la dynéine peuvent être formés dans le cytosol préparé dans des conditions de stabilisation des microtubules, et CyP-A se colocalise dans les fibroblastes de souris avec des microtubules. La colocalisation avec les microtubules est perturbée par la surexpression du fragment du domaine PPIase. Ainsi, nous concluons que CyP-A s'associe in vitro et in vivo au complexe dynéine/protéine motrice dynactine et nous suggérons que CyP-A peut remplir une fonction générale liée à la liaison de la cargaison pour un mouvement rétrograde le long des microtubules. Les cyclophilines (CyPs) 1Les abréviations utilisées sont : CyP, cyclophiline ; CyP-A, cyclophiline-A ; PPIase, peptidylprolyl isomérase ; FKBP, protéine de liaison à la FK506 ; hsp, protéine de choc thermique ; CsA, cyclosporine A ; CyP-40, cyclophiline 40 ; TPR, répétition tétratricopeptide ; GR, récepteur des glucocorticoïdes ; GST, glutathion S-transférase ; GSH, glutathion ; DIC, chaîne intermédiaire de la dynéine ; tes, acide 2-{[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxyméthyl)éthyl]amino}éthanesulfonique ; Mes, acide 4-morpholineéthanesulfonique ; HISS, solution à force ionique élevée ; VIH, virus de l'immunodéficience humaine.1Les abréviations utilisées sont : CyP, cyclophiline ; CyP-A, cyclophiline-A ; PPIase, peptidylprolyl isomérase ; FKBP, protéine de liaison à la FK506 ; hsp, protéine de choc thermique ; CsA, cyclosporine ; CyP-40, cyclophiline ; TPR, tétratricopeptide ; GR, récepteur des glucocortiques ; GST, glutathionase, glutathion ; GSH, glutathion ; dytransférine intermédiaire ; Dys [2-hydroxy-1,1-bis(hydroxyméthyl)éthyl] éthanesulfonique. 1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1315-1347Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar et 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Les cyclophilines se lient au médicament cyclosporine A (CsA), et une deuxième classe d'immunophilines, les protéines de liaison à la FK506 (FKBP), se lie aux médicaments immunosuppresseurs FK506 et à la rapamycine. Les immunophilines possèdent une activité peptidylprolyl isomérase (PPIase), et les médicaments immunosuppresseurs occupent le site PPIase sur l'immunophiline, bloquant sa capacité à diriger l'isomérisation des cistrans des liaisons peptidylprolyle in vitro. CyP-A a été isolé en tant que protéine de liaison à haute affinité de 17 kDa pour la cyclosporine A (3Handschumacher R.E. Harding M.W. Rice J. Drugge R.J. Speicher D.W. Science. 1984 ; 226: 544-547Crossref PubMed Scopus (1452) Google Scholar), et il a ensuite été démontré qu'elle était la même qu'une protéine de 17 kDa (4Fischer G. Wittmann-Liebold B. Lang K. Kiefhaber T. Schmid F.X. Nature. 1989 ; 337: 476-478Crossref PubMed Scopus (1209) Google Scholar, 5Takahashi N. Hayano T. Suzuki M. Nature. 1989 ; 337: 473-475Crossref PubMed Scopus (939) Google Scholar) qui était connu pour avoir une activité PPIase et pour accélérer le repliement de la protéine dénaturée à l'urée in vitro (6Fischer G. Bang H. Biochim. Biophys. Acta. 1985 ; 828: 39-42Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar). Il a ensuite été démontré que la CyP-A dirige l'effet immunosuppresseur de la CsA (7Liu J. Immunol. Aujourd'hui. 1993 ; 14: 290-295Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar), et le petit FKBP, FKBP12, s'est avéré être la cible des effets immunosuppresseurs du FK506 et de la rapamycine (8Bierer B.E. Mattila P.S. Standaert R.F. Herzenberg L.A. Burakoff S.J. Crabtree G. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990 ; 87: 9231-9235Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). Tant dans le cas de la CyP-A liée à la CsA que dans celui de la FKBP12 liée à la FK506, la cible ultime du complexe médicament-immunophiline est la protéine phosphatase calcineurine (pour la revue, voir Réf. 9Livraison M.T. Med. Res. Rev. 2000 ; 20: 452-484Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). La cible ultime de la FKBP12 liée à la rapamycine est une kinase liée à la phosphoinositide 3-kinase appelée FRAP (FKBP-rapamycin-associated protein) (10Brown E.J. Albers M.W. Shin T.B. Ichikawa K. Keith C.T. Lane W.S. Schreiber S.L. Nature. 1994 ; 369: 756-758Crossref PubMed Scopus (1661) Google Scholar), RAFT1 (rapamycine et FKBP12 cible 1) (11Sabatini D.M. Erdjument-Bromage H. Lui M. Tempst P. Snyder S.H. Cell. 1994 ; 78: 35-43Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1221) Google Scholar), ou mTOR (mammalian target of rapamycin) (12Schmelzle T. Hall M.N. Cell. 2000 ; 103: 253-262Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1724) Google Scholar). Ni les médicaments immunosuppresseurs ni les immunophilines CyP-A et FKBP12 ne se lient seules aux secondes cibles protéiques pour l'immunosuppression. Seuls les complexes médicament-immunophiline se lient à la calcineurine ou à FRAP/RAFT1/mTOR. Bien que la plupart des travaux sur les immunophilines se soient concentrés sur les petits CyP et FKBP, comme CyP-A et FKBP12, des immunophilines de haut poids moléculaire ont été identifiées qui contiennent des domaines pour des interactions protéiques supplémentaires ou une activité enzymatique ainsi qu'un domaine PPIase qui se lie aux médicaments immunosuppresseurs (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Plusieurs de ces immunophilines de poids moléculaire élevé ont été découvertes en tant que composants des hétérocomplexes du récepteur des stéroïdes hsp90. Ils comprennent CyP-40, FKBP51 et FKBP52 (examinés dans la réf. 13Pratt W.B. Toft D.O. Exp. Biol. Med. 2003 ; 228: 111-133Crossref PubMed Scopus (1260) Google Scholar), et ils ne sont pas impliqués dans les actions immunosuppressives de CsA ou FK506. Ces immunophilines possèdent des domaines de répétition de tétratricopeptides (TPR) qui se lient à un site accepteur de TPR situé dans la terminaison C de la protéine abondante et ubiquitaire chaperone hsp90. Deux rôles ont été proposés pour ces immunophilines se liant à hsp90 dans l'action des récepteurs stéroïdiens. Riggs et al. (14Riggs D.L. Roberts P.J. Chirillo S.C. Cheung-Flynn J. Prapapanich V. Ratajczak T. Gaber R. Picard D. Smith D.F. EMBO J. 2003 ; 22: 1158-1167Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar) ont montré que FKBP52 potentialise sélectivement l'activation du gène rapporteur dépendant du récepteur des glucocorticoïdes (GR) en augmentant l'affinité de liaison hormonale du récepteur. Cet effet nécessite l'activité prolyl isomérase de FKBP52 et est bloqué par FK506. Une autre ligne de recherche s'est concentrée sur le rôle des immunophilines se liant à hsp90 dans le ciblage du mouvement du GR vers le noyau (revue dans Ref. 15Pratt W.B. Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. Signal. 2004 ; 16: 857-872Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). L'action de ces immunophilines dans le mouvement des récepteurs n'est pas affectée par la présence de médicaments immunosuppresseurs et ne nécessite donc pas d'activité prolyl isomérase. En plus des immunophilines du domaine TPR, les hétérocomplexes GR·hsp90 immunoadsorbés à partir de lysats cellulaires contiennent de la dynéine cytoplasmique (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 14884-14889Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 17Davies T.H. Ning Y.M. Sanchez E.R. J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 4597-4600Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar), a molecular motor that processes along microtubule tracks towards the nucleus (18Vallee R.B. Gee M.A. Trends Cell Biol. 1998 ; 8: 490-494Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). Dans ces complexes, le domaine PPIase de l'immunophiline fonctionne comme un domaine de liaison aux protéines pour lier l'unité GR·hsp90 au moteur protéique (19Silverstein A.M. Galigniana M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 36980-36986Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. Galigniana M.D. Biochemistry. 2002 ; 41: 5581-5587Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002 ; 41: 13602-13610Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). La liaison de l'immunophiline à la dynéine cytoplasmique est indirecte au moyen de la composante dynamitine du complexe dynactine associé à la dynéine (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004 ; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). La liaison de CyP-40 ou FKBP52 à la dynéine est concurrencée par un fragment purifié du domaine PPIase de FKBP52 (21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002 ; 41: 13602-13610Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar), et il a été démontré que le FKBP52 purifié se lie directement via son domaine PPIase à la dynamitine immunopurifiée (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004 ; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). Il existe un degré élevé de similitude dans la structure du domaine PPIase entre les différentes cyclophilines (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Le domaine PPIase de la CyP-40 bovine, par exemple, partage 61% d'identité avec la séquence de la CyP-A humaine,et à une exception près, les résidus du site actif sont identiques (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Ainsi, nous avons demandé si CyP-A, comme son homologue de haut poids moléculaire se liant à hsp90 CyP-40, se lie par son domaine PPIase au complexe dyneine/dynactine. Ici, nous montrons que l'immunoadsorption de CyP-A à partir du lysat de réticulocytes ou du cytosol des cellules L produit une co-immunoadsorption de la dynéine cytoplasmique. La liaison à la dynéine est indirecte via le composant dynamitine du complexe dynactine associé à la dynéine, et CyP-A se lie à la dynamitine d'une manière qui est concurrencée par un fragment de domaine PPIase purifié de FKBP52. L'immunoprécipitation de CyP-A à partir du cytosol contenant du paclitaxel et du GTP pour stabiliser les microtubules donne la coprécipitation de la tubuline et de la dynéine d'une manière dépendante du domaine PPIase, et Cyp-A se colocalise avec les microtubules dans les cellules NIH 3T3. L'observation selon laquelle CyP-A est associé au complexe protéine motrice de la dynéine/dynactine à base de microtubules devrait être utile pour éventuellement définir la ou les fonctions d'entretien de cette immunophiline à domaine unique dans les cellules de mammifères en l'absence de médicaments immunosuppresseurs. Matériaux-Lysat de réticulocytes de Lapin provenait de Green Hectares (Oregon, WI). Le mélange complet d'inhibiteurs de protéase Mini a été acheté chez Roche Diagnostics (Mannheim, Allemagne). Le milieu de transfection Opti-MEM I provenait d'Invitrogen. Le réactif de transfection Trans-Fast provenait de Promega (Madison, WI). Les réactifs de chimiluminescence Enhance provenaient d'Amersham Biosciences. Le glutathion-agarose, la protéine A-Sépharose, la geldanamycine, l'hirudine, le CsA, le paclitaxel, les IgG monoclonales de rat contre l'α-tubuline, les IgG monoclonales de souris contre la GST et les anticorps anti-souris et anti-rats d'âne conjugués à la peroxydase de raifort ont été achetés auprès de Sigma. Les IgG polyclonales de lapin A-14 contre l'oligopeptide c-myc provenaient de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Les contre-anticorps fluorescents provenaient d'Immuno-Chemicals (West Grove, PA). Les cellules de chèvre anti-IgG de lapin conjuguées à la peroxydase de raifort et les cellules d'Escherichia coli BL21-compétentes provenaient de Pierce. L'antisérum polyclonal de lapin contre la CyP-A a été préparé dans le laboratoire Scripps par immunisation avec la protéine humaine recombinante CyP-A (23Saphire A.C. Bobardt M.D. Gallay P.A. EMBO J. 1999 ; 18: 6771-6785Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar). Les IgG monoclonales de souris contre la chaîne intermédiaire de 74 kDa de la dynéine cytoplasmique de mammifère ont été achetées à Chemicon (Temecula, CA). Le plasmide pGEX1λT codant pour le vecteur d'expression GST-rabbit FKBP52 Gly32-Lys138 qui comprend le domaine central PPIase I (fourni par les Drs Michel Renoir et Christine Radanyi, UMR8612 CNRS, Paris, France) et la purification de la protéine du domaine central PPIase I ont été décrits précédemment (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). Le plasmide pECFP-N1 pour l'expression de la protéine fluorescente cyanine a été fourni par le Dr Rainer Benndorf (University of Michigan Medical School, Ann Arbor, MI). The baculovirus for the FLAG-tagged TPR domain of rat protein phosphatase 5 (24Chen M.S. Silverstein A.M. Pratt W.B. Chinkers M.J. Biol. Chem. 1996 ; 271: 32315-32320Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar) a été aimablement fourni par le Dr Michael Chinkers (University of South Alabama, Mobile, AL). The myc-tagged pCMVH50m construct encoding for p50/dynamitin (25Burkhardt J.K. Echeverri C.J. Nilsson T. Vallee R.B. J. Cell Biol. 1997 ; 139: 469-484Crossref PubMed Scopus (556) Google Scholar) était un cadeau aimable du Dr Richard Vallee (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA). Le plasmide pGEX-2T codant pour GST-CyP-A était un cadeau aimable du Dr Jeremy Luban (Columbia University) (26Luban J. Bossolt K.L. Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993 ; 73: 1067-1078Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar). Tous les tampons d'incubation utilisés dans ces études ont été complétés par des inhibiteurs de protéase (1 comprimé de Complete Mini Plus 1000 unités d'hirudine/2 ml de tampon). Coimmunoadsorption of Endogenous CyP-A and Dynein—50 μl of reticulocyte lysate were immunoadsorbed to 16 μl of protein A-Sepharose with either 5 μl of rabbit antiserum against CyP-A or 5 μl of mouse IgG against dynein intermediate chain. Après 2 h à 4 °C, les culots ont été lavés avec du tampon TEGM (10 mm tes à pH 7,6, 50 mm NaCl, 4 mm EDTA, 10% v/v glycérol et 20 mm Na2MoO4). Les protéines ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, électrotransférées sur une membrane Immobilon P et Western blottées. Formation de complexes avec GSH-Agarose-immobilisé GST-CyP A—80 μl de GSH-agarose dans 80 μl de tampon TEG (tampon TEGM sans molybdate) ont été incubés à 4 °C pendant 2 h avec 10 μl de cytosol de BL21 E. coli surexprimant soit la GST humaine soit la GST-CyP-A humaine. Les culots ont été lavés et réincubés pendant deux heures supplémentaires dans du tampon TEG supplémenté avec 0,5 m NaCl et 0,05% Nonidet P-40 et lavés trois fois avec du tampon TEG et deux fois avec 10 mm Hepes à pH 7,5. Les culots lavés contenant du GST-CyP-A immobilisé (ou du GST seul) ont été incubés pendant 30 min à 30 °C avec 50 μl de lysat réticulocytaire supplémenté en inhibiteurs de protéase, 5 μl d'un système de régénération de l'ATP (ATP 50 mm, phosphate de créatine 250 mm, acétate de magnésium 20 mm et créatine phosphokinase 100 unités/ml), et les peptides indiqués en tampon HKD (Hepes 10 mm à pH 7,5, KCl 100 mm et dithiothréitol 2 mm). La liaison de CyP-A aux fibroblastes de souris Dynamitin-L929 a été cultivée dans le milieu Eagle's modifié de Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau bovin et des antibiotiques. Lorsque les cellules étaient confluentes à 50 %, le milieu a été remplacé par le milieu de transfection Opti-MEM I et l'incubation s'est poursuivie pendant 1 h. Le milieu a été aspiré et remplacé par un mélange de transfection (à un rapport liposome de 3 μl/μg ADN) préincubé pendant 15 min à température ambiante dans Opti-MEM I, qui contenait 3 μg du plasmide pCMVH50m marqué myc codant pour p50/dynamitine. Après 1,5 h de transfection, le mélange a été remplacé par du milieu régulier. Après 36 h, les cellules ont été récoltées et rompues par homogénéisation Dounce dans du tampon HE (Hepes 10 mm à pH 7,5, EDTA 1 mm et inhibiteurs de protéase) et centrifugées à 100 000 × g pendant 30 min. Le cytosol cellulaire (250 μl) a été mis en rotation pendant 2 h à 4 °C avec 16 μl de protéine A-Sépharose et 10 μl d'anticorps anti-myc. Le surnageant a été aspiré, et le culot a été débarrassé des protéines co-immunoadsorbées par préincubation avec du tampon supplémenté avec 0,5 m NaCl et 0,05% Nonidet P-40. Après 2 h, les échantillons ont été lavés trois fois avec du tampon TEG et deux fois avec du tampon HE. Les culots ont été incubés sur de la glace avec 10 μl de lysat bactérien surexprimant GST-CyP-A en présence ou non de 90 μg de domaine PPIase purifié de FKBP52. Le volume final a été ajusté à 50 μl avec du tampon HKD. Après 1 h, les culots ont été lavés avec du tampon TEGM et les protéines ont été résolues par électrophorèse suivie d'un Western blot. Préparations stabilisées par des microtubules - Les fibroblastes L929 ont été incubés pendant 15 min avec du paclitaxel 20 μm avant la rupture par homogénéisation Dounce dans du tampon mes (0,1 m Mes, 1 mm EGTA et 1 mm MgCl2, pH 6,9) supplémenté avec du paclitaxel 20 μm, du GTP 100 μm et des inhibiteurs de protéase. Avant l'adsorption, 0,05% de Nonidet P-40 a été ajouté au cytosol et il a été tourné pendant 30 min à 4 °C, puis centrifugé à 30 p.s.i. pendant 15 min dans un Airfuge. Des aliquotes (250 μl) de cytosol ont été incubées à 30 °C pendant 30 min avec 25 μl de lysat de bactéries non expressives et 50 μl de tampon HKD ou 25 μl de lysat de bactéries surexprimant GST-CyP-A et 50 μl de tampon HKD ou 25 μl de lysat de bactéries surexprimant GST-CyP-A et 325 μg de domaine PPIase purifié de FKBP52 dans le tampon HKD. Le tampon HKD contenait également des inhibiteurs de protéase. GST-CyP-A a ensuite été immobilisé par rotation avec du GSH-agarose pendant 2 h à 4 °C. Les culots ont été lavés avec du tampon TEGM, et les protéines ont été résolues par immunoblotting Immunoblotting - Les culots immunitaires ont été résolus sur des gels de polyacrylamide SDS-10% et transférés sur des membranes Immobilon P. Les membranes ont été sondées avec 0,1 % de MAB1618 pour la chaîne intermédiaire de la dynéine, 0,1 % de A-14 pour la myc-dynamitine, 0,05 % d'antisérum de lapin pour la CyP-A et 0,05 % d'IgG de souris pour la GST. Les cellules Indirect Immunofluorescence-NIH 3T3 ont été cultivées sur des lamelles de 11 × 22 mm recouvertes de fibrinogène dans le milieu Eagle's modifié de Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau bovin et des antibiotiques. Les lamelles ont été rincées avec une solution phosphate-saline et fixées pendant 4 h dans une solution de p-formaldéhyde à 4% fraîchement préparée dans un tampon phosphate-saline. Les cellules ont été perméabilisées en immergeant les lamelles dans de l'acétone à -20 °C pendant 15 min. Après avoir lavé les lamelles avec du tampon phosphate salin, elles ont été préincubées pendant 1 h à température ambiante dans du tampon HISS (solution à haute force ionique) (Tris 20 mm à pH 8,0, NaCl 0,63 m, Tween 20 0,1 % et sérum albumine bovine 3,5 %) supplémenté avec 1 % de sérum de cheval. Les cellules ont été lavées dans du tampon HISS et immunocolorées en retournant les lamelles sur une solution de 50 μl de tampon HISS contenant 1 μl d'anti-α-tubuline de rat et 0,2 μl de sérum de lapin anti-CyP-A. Après 2 h à température ambiante dans une chambre humide, les cellules ont été lavées dans un tampon HISS pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec une dilution au 1/100 des contre-anticorps correspondants (IgG anti-rabbit d'ânesse conjuguée à la rhodamine et IgG anti-rat d'ânesse conjuguée à l'isothiocyanate de fluorescéine). Les lamelles ont été montées sur des lames de microscope à l'aide d'une goutte de milieu de montage Antifade (Molecular Probes, Leiden, Pays-Bas), et les cellules ont été observées avec un microscope confocal Olympus Fluo-view-500. CyP-A est récupéré dans un hétérocomplexe natif avec de la dynéine. Pour déterminer si CyP-A existe dans des hétérocomplexes natifs avec de la dynéine, le lysat de réticulocytes a été immunoadsorbé avec des anticorps dirigés contre l'immunophiline ou contre la chaîne intermédiaire de la dynéine et les protéines associées aux culots immunitaires lavés ont été détectées par immunoblotting. Comme le montre la Fig. 1A, l'immunoadsorption de la dynéine a entraîné la coadsorption de CyP-A (voie 3) et l'immunoadsorption de CyP-A a entraîné la coadsorption de la dynéine (voie 5), ce qui est conforme à la notion selon laquelle CyP-A existe dans des hétérocomplexes natifs avec la dynéine cytoplasmique. Dans la figure 1, voies 6 à 9, les voies entières pour chaque immunopellet ont été tamponnées avec chaque anticorps pour démontrer la spécificité de l'interaction. Pour montrer que le complexe n'implique pas seulement de petites quantités de l'une ou l'autre protéine, une grande quantité de CyP-A a été immunoadsorbée à partir du lysat de réticulocytes et l'immunodéplétion résultante de la dynéine a été évaluée. Comme le montre la Fig. 1B, l'augmentation de l'immunoadsorption de la CyP-A s'accompagnait d'une augmentation de la coadsorption de la dynéine (voies 3 et 4). À la quantité plus élevée d'anticorps, la majeure partie de la CyP-A et une quantité substantielle de la dynéine ont été adsorbées à partir du lysat réticulocytaire (cf. piste 7 avec piste 5). En balayant les voies avec un PhosphorImager et en soustrayant une valeur de fond adjacente, des unités arbitraires pour chaque protéine restant dans le surnageant non immunitaire (voie 5) et le surnageant immunitaire le plus élevé (voie 7) ont été déterminées. Une déplétion de 75 % de CyP-A a donné 59 % de codéplétion de la dynéine, indiquant qu'une majorité de chaque protéine est dans un hétérocomplexe contenant l'autre protéine. Pour montrer que la liaison n'est pas une interaction faible et peut-être non spécifique, le lysat de réticulocytes a été immunoadsorbé avec l'anti-CyP-A et les culots immuns ont été lavés dans des conditions de plus en plus difficiles. Comme le montre la Fig. 1C, le complexe de CyP-A avec la dynéine a persisté lors du lavage avec du tampon TEG plus 100 mm NaCl (cf. pistes 2 et 3) et du lavage avec TEG plus NaCl et 0,1 % Nonidet P-40 (piste 3). Le lavage dans des conditions détergentes très difficiles (NaCl, Nonidet P-40, 0,5 % de désoxycholate et 1 % de dodécylsulfate de sodium) dissocie l'anticorps CyP-A du culot de protéine A-Sépharose de sorte que la plupart de la CyP-A et de la dynéine sont perdus. Néanmoins, certains complexes de CyP-A et de dynéine peuvent être observés dans ces conditions de lavage très dures (voie 5). Nous avons déjà utilisé un lysat de réticulocytes pour obtenir un assemblage acellulaire de complexes GR·hsp90 contenant des immunophilines se liant à hsp90 et de la dynéine (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). Dans l'expérience de la Fig. 2, GST-CyP-A a été immobilisé sur des billes de glutathion et les billes ont été incubées avec un lysat de réticulocytes dans les mêmes conditions d'assemblage de l'hétérocomplexe GR. Les billes de glutathion liées à la GST seule ne contenaient pas de dynéine après incubation avec le lysat de réticulocytes (voie 2), mais les billes liées à la GST-CyP-A contenaient de la dynéine (voie 5). CyP-A PPIase Domain Is Required for Complex with Dynein—The formation of heterocomplexes containing the hsp90-binding immunophilins and dynein requires the PPIase domain of the immunophilin and can be blocked by competition with the PPIase domain fragment of FKBP52 (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 14884-14889Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 19Silverstein A.M. GALIGNIANA M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 36980-36986Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. Galigniana M.D. Biochemistry. 2002 ; 41: 5581-5587Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002 ; 41: 13602-13610Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). Dans l'expérience de la Fig. 3, des billes liées à GST-CyP-A ont été incubées avec un lysat de réticulocytes en présence d'un lysat de bactéries exprimant le fragment du domaine PPIase FKBP52 et les billes ont ensuite été lavées et testées pour les protéines liées. La présence du fragment de domaine PPIase a empêché l'association de CyP-A avec la dynéine (cf. voies 2 et 4), alors que la présence d'un fragment de domaine TPR n'a pas affecté la liaison à la dynéine (voie 5). Nous avons montré précédemment que le fragment du domaine TPR inhibe la liaison des immunophilines du domaine TPR à hsp90 mais n'affecte pas leur liaison à la dynéine (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). Il est important de noter que la CsA n'affecte pas la formation d'un complexe CyP-A avec la dynéine (voie 6), ce qui suggère que l'activité de la prolyl isomérase n'est pas nécessaire. CyP-A Interaction avec la dynamitine - Récemment, nous avons démontré que le FKBP52 purifié se lie directement à la myc-dynamitine purifiée, un composant de 50 kDa du complexe dynactine associé à la dynéine (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004 ; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). Sur la figure 4, l'anticorps anti-myc a été utilisé pour immunoadsorber le cytosol des cellules surexprimant la myc-dynamitine et le culot immunitaire dépouillé de sel a été incubé avec du lysat de bactéries exprimant la GST-CyP-A. La GST-CyP-A liée à la myc-dynamitine (condition 2), et la liaison a été bloquée par le fragment PPIase de FKBP52 (condition 3). Ainsi, à l'instar des immunophilines se liant à hsp90, CyP-A semble s'associer indirectement à la dynéine en se liant à la dynamitine. La tubuline est présente dans les hétérocomplexes CyP-A - Nous avons récemment montré que les hétérocomplexes GR immunoadsorbés à partir du cytosol des cellules L préparé avec un tampon stabilisant les microtubules contiennent de la tubuline ainsi que de la dynéine. 2J. M. Harrell, M. D. Galigniana, P. J. M. Murphy, Y. Morishima et W. B. Pratt, manuscrit en préparation. Dans l'expérience de la Fig. Les cellules 5, L ont été traitées brièvement avec du paclitaxel, puis rompues dans un tampon contenant à la fois du paclitaxel et du GTP pour stabiliser les microtubules. Le cytosol a également été préparé sans les conditions de stabilisation des microtubules. Du lysat de bactéries exprimant GST-CyP-A a été ajouté à chaque préparation de cytosol, le mélange a été incubé et le GST-CyP-A a été adsorbé sur des billes de glutathion. Comme le montre la figure 5, condition 2, la dynéine est présente dans les pastilles de GST-CyP-A préparées dans l'une ou l'autre condition, mais la tubuline n'est présente que lorsque la GST-CyP-A est adsorbée à partir du cytosol préparé dans des conditions de stabilisation des microtubules. Si le fragment du domaine PPIase est présent pour concurrencer la liaison de CyP-A à la dynamitine, ni la dynéine ni la tubuline ne sont présentes dans le culot de GST-CyP-A (condition 3). Cette découverte soutient un modèle dans lequel la CyP-A est liée aux microtubules via son association avec le complexe dynéine/dynactine. CyP-A est localisé aux microtubules dans Vivo-In Fig. Les fibroblastes de souris 6, 3T3 ont été co-transfectés avec des plasmides codant pour le fragment du domaine PPIase de FKBP52 et la protéine fluorescente cyanine. Après 36 h, les cellules ont été fixées et immunocolorées pour la tubuline (Fig. 6A, vert) et CyP-A (Fig. 6B, rouge). Dans les cellules non transfectées, on observe une colocalisation de CyP-A avec la tubuline (voir fusionner à la Fig. 6C). L'image bleue de la Fig. 6D montre une cellule cotransfectée au milieu du champ. L'expression du fragment du domaine PPIase n'a pas affecté le schéma fibrillaire des microtubules (Fig. 6A), mais il a perturbé la distribution fibrillaire de CyP-A (Fig. 6B). Ceci est cohérent avec le fragment du domaine PPIase en compétition pour la localisation de CyP-A aux microtubules. Ici, nous avons montré que l'immunophiline à domaine unique, CyP-A, se comporte comme les immunophilines du domaine TPR se liant à hsp90 en se liant au complexe de la protéine motrice de la dynéine cytoplasmique (Fig. 1). Le fragment du domaine PPIase de FKBP52 est en compétition pour la liaison à la dynéine ; cependant, dans la mesure où la liaison se produit en présence ou en l'absence de CsA (Fig. 3), l'activité isomérase de CyP-A n'est pas nécessaire. Ainsi, la liaison des domaines PPIase de l'immunophiline au complexe protéique moteur est très différente de la liaison de CyP-A ou FKBP12 à la calcineurine où seule l'immunophiline liée à CsA ou FK506 est un partenaire de liaison à la calcineurine. Encore une fois, comme les immunophilines se liant à hsp90, CyP-A semble se lier indirectement à la dynéine par une interaction de son domaine PPIase avec le composant dynamitine du complexe dynactine associé à la dynéine (Fig. 4). Les moteurs de la dynéine cytoplasmique fonctionnent le long des pistes de microtubules, et nous montrons que les hétérocomplexes CyP-A contenant de la tubuline et de la dynéine peuvent être formés dans le cytosol dans des conditions de stabilisation des microtubules (Fig. 5). Fait important, nous montrons que CyP-A colocalise avec des microtubules dans les fibroblastes de souris 3T3 et que la liaison aux microtubules in vivo est perturbée par la surexpression du fragment du domaine PPIase de FKBP52 (Fig. 6). Prises ensemble, les observations in vitro et in vivo soutiennent un modèle dans lequel CyP-A est associé au système de mouvement rétrograde en tant que complexe CyP-A-dynamitine-dynéine-microtubule. CyP-A est présente en tant que protéine relativement abondante dans le cytoplasme de toutes les cellules de mammifères (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Ainsi, il doit effectuer certaines fonctions générales d'entretien ménager importantes pour l'homéostasie cellulaire. À ce jour, les études de CyP-A se sont largement concentrées sur sa structure et son action immunosuppressive par l'association du complexeCyP-A ·CsA avec la calcineurine (1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1315-1347Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar, 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003 ; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Des rapports occasionnels ont noté l'association de CyP-A avec des protéines spécifiques, telles que le suppresseur YY1 de la transcription des gènes (27Yang W.M. Inouye C.J. Seto E.J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 15187-15193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar) and human immunodeficiency virus, type 1 Pr55gag polyprotein precursor (26Luban J. Bossolt K.L. Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993 ; 73: 1067-1078Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar, 28Yoo S. Myszka D.G. Yeh C.Y. McMurray M. Hill C.P. Sundquist W.I. J. Mol. Biol. 1997 ; 269: 780-795Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Cependant, les associations rapportées n'ont pas conduit à un modèle général de la fonction CyP-A dans les cellules de mammifères en l'absence de CsA. L'association de CyP-A avec le complexe de la protéine motrice de la dynéine/dynactine pourrait révéler une fonction générale d'entretien ménager. On pense que la dynéine se lie indirectement à sa cargaison par l'intermédiaire de la dynactine, mais on ne sait pas comment la cargaison est reconnue (29Hirokawa N. Science. 1998 ; 279: 519-526Crossref PubMed Scopus (1369) Google Scholar). Nous avons résumé dans l'introduction comment les immunophilines du domaine TPR ciblent deux protéines régulées par hsp90, la GR et la p53, vers le complexe dynéine/dynactine pour leur mouvement rétrograde vers le noyau (15Pratt W.B. Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. Signal. 2004 ; 16: 857-872Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). CyP-A pourrait participer à une telle reconnaissance de cargaison directement ou indirectement dans le cadre d'un complexe protéique. Il est intéressant de noter que plusieurs éléments de preuve suggèrent que le VIH utilise la dynéine et le réseau de microtubules pour transporter son génome vers le noyau. Parce que le VIH nécessite que CyP-A se réplique efficacement dans les cellules humaines (30FRANKE E.K. Yuan H.E Luban J. Nature. 1994 ; 372: 359-362Crossref PubMed Scopus (645) Google Scholar, 31Thali M. Bukovsky A. Kondo E. Rosenwirth B. Walsh C.T. Sodroski J. Gottlinger H.G. Nature. 1994 ; 372: 363-365Crossref PubMed Scopus (559) Google Scholar), on peut envisager que CyP-A agisse comme connecteur entre le VIH et le réseau de microtubules afin de faciliter une transmission sécurisée du génome viral au noyau. Nous remercions Rainer Benndorf, Michael Chinkers, Jeremy Luban, Christine Radanyi, Michel Renoir et Richard Vallee d'avoir fourni les réactifs utilisés dans ce travail.

Aunque la ciclofilina A (CyP-A) es una inmunofilina pequeña relativamente abundante presente en el citoplasma de todas las células de mamíferos, se desconoce su función general en ausencia del fármaco inmunosupresor ciclosporina A. Por el contrario, las inmunofilinas de unión a hsp90 de alto peso molecular parecen desempeñar un papel en el tráfico de proteínas, ya que se ha demostrado que unen los complejos del receptor de glucocorticoides-hsp90 y p53·hsp90 a la proteína motora dineína para el movimiento retrógrado a lo largo de los microtúbulos. Estas inmunofilinas se unen a la dineína citoplasmática indirectamente a través de la asociación del dominio de inmunofilina peptidilprolil isomerasa (PPIasa) con dinamitina, un componente del complejo de dinactina asociado a dineína (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., Ljungman, M. y Pratt, W. B. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22483-22489). Aquí, mostramos que CyP-A existe en heterocomplejos nativos que contienen dineína citoplasmática que se puede formar en sistemas libres de células. La actividad de prolil isomerasa no es necesaria para formar el complejo de dineína, pero el fragmento del dominio PPIasa de FKBP52 bloquea la formación del complejo y CyP-A se une a la dinamitina de una manera dependiente del dominio PPIasa. Los heterocomplejos de CyP-A que contienen tubulina y dineína se pueden formar en el citosol preparado en condiciones de estabilización de microtúbulos, y CyP-A se colocaliza en fibroblastos de ratón con microtúbulos. La colocalización con microtúbulos se interrumpe por la sobreexpresión del fragmento del dominio PPIasa. Por lo tanto, concluimos que CyP-A se asocia in vitro e in vivo con el complejo de proteínas motoras dineína/dinactina y sugerimos que CyP-A puede realizar una función general relacionada con la unión de la carga para el movimiento retrógrado a lo largo de los microtúbulos. Aunque la ciclofilina A (CyP-A) es una inmunofilina pequeña relativamente abundante presente en el citoplasma de todas las células de mamíferos, se desconoce su función general en ausencia del fármaco inmunosupresor ciclosporina A. Por el contrario, las inmunofilinas de unión a hsp90 de alto peso molecular parecen desempeñar un papel en el tráfico de proteínas, ya que se ha demostrado que vinculan los complejos del receptor de glucocorticoides-hsp90 y p53·hsp90 a la proteína motora dineína para el movimiento retrógrado a lo largo de los microtúbulos. Estas inmunofilinas se unen a la dineína citoplasmática indirectamente a través de la asociación del dominio de inmunofilina peptidilprolil isomerasa (PPIasa) con dinamitina, un componente del complejo de dinactina asociado a dineína (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., Ljungman, M. y Pratt, W. B. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22483-22489). Aquí, mostramos que CyP-A existe en heterocomplejos nativos que contienen dineína citoplasmática que se puede formar en sistemas libres de células. La actividad de prolil isomerasa no es necesaria para formar el complejo de dineína, pero el fragmento del dominio PPIasa de FKBP52 bloquea la formación del complejo y CyP-A se une a la dinamitina de una manera dependiente del dominio PPIasa. Los heterocomplejos de CyP-A que contienen tubulina y dineína se pueden formar en el citosol preparado en condiciones de estabilización de microtúbulos, y CyP-A se colocaliza en fibroblastos de ratón con microtúbulos. La colocalización con microtúbulos se interrumpe por la sobreexpresión del fragmento del dominio PPIasa. Por lo tanto, concluimos que CyP-A se asocia in vitro e in vivo con el complejo de proteínas motoras dineína/dinactina y sugerimos que CyP-A puede realizar una función general relacionada con la unión de la carga para el movimiento retrógrado a lo largo de los microtúbulos. Las ciclofilinas (CyPs) 1Las abreviaturas utilizadas son: CyP, ciclofilina; CyP-A, ciclofilina-A; PPIasa, peptidilprolil isomerasa; FKBP, proteína de unión a FK506; hsp, proteína de choque térmico; CsA, ciclosporina A; CyP-40, ciclofilina 40; TPR, repetición de tetratricopéptido; GR, receptor de glucocorticoides; GST, glutatión S-transferasa; GSH, glutatión; dic, cadena intermedia de dineína; tes, ácido 2-{[2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil]amino}etanosulfónico; Mes, ácido 4-morfolinetanosulfónico; HISS, solución de alta fuerza iónica; VIH, virus de inmunodeficiencia humana.1Las abreviaturas utilizadas son: CyP, ciclofilina; CyP-A, ciclofilina-A; PPIasa, peptidilpropil isomerasa; FKBP, proteína de unión a FK506; hsp, proteína de choque térmico; Cs, ciclosporina AP-40, ciclofilina 40; TPR, tetratripéptido; GR, receptor de glucocorticoide; GST, glutatión, S-transferasa; GSH, cadena intermedia de GSH, 2; GSH, cadena intermedia de ácido 2-hidroxi-1,2-metanosulfónico (FKBP, proteína de unión a 4-hidroxi). 1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1315-1347Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar y 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Las ciclofilinas se unen al fármaco ciclosporina A (CsA), y una segunda clase de inmunofilinas, las proteínas de unión a FK506 (FKBP), se unen a los fármacos inmunosupresores FK506 y rapamicina. Las inmunofilinas poseen actividad peptidilprolil isomerasa (PPIasa), y los fármacos inmunosupresores ocupan el sitio de la PPIasa en la inmunofilina, bloqueando su capacidad para dirigir la isomerización de cistranos de los enlaces peptidilprolilo in vitro. CyP-A se aisló como una proteína de unión de alta afinidad de 17 kDa para ciclosporina A (3Handschumacher R.E. Harding M.W. Rice J. Drugge R.J. Speicher D.W. Science. 1984; 226: 544-547Crossref PubMed Scopus (1452) Google Scholar), y más tarde se demostró que era la misma que una proteína de 17 kDa (4Fischer G. Wittmann-Liebold B. Lang K. Kiefhaber T. Schmid F.X. Nature. 1989; 337: 476-478Crossref PubMed Scopus (1209) Google Scholar, 5Takahashi N. Hayano T. Suzuki M. Nature. 1989; 337: 473-475 Crossref PubMed Scopus (939) Google Scholar) que se sabía que tenía actividad PPIasa y que aceleraba el replegamiento de la proteína desnaturalizada con urea in vitro (6Fischer G. Bang H. Biochim. Biophys. Acta. 1985; 828: 39-42Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar). Posteriormente se demostró que CyP-A dirige el efecto inmunosupresor de CsA (7Liu J. Immunol. Today. 1993; 14: 290-295Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar), y el pequeño FKBP, FKBP12, demostró ser el objetivo de los efectos inmunosupresores de FK506 y rapamicina (8Bierer B.E. Mattila P.S. Standaert R.F. Herzenberg L.A. Burakoff S.J. Crabtree G. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 9231-9235Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). Tanto en el caso de CyP-A unida a CsA como en el de FKBP12 unida a FK506, el objetivo final del complejo fármaco-inmunofilina es la proteína fosfatasa calcineurina (para una revisión, consulte la Ref. 9Ivery M.T. Med. Res. Rev. 2000; 20: 452-484Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). El objetivo final para la FKBP12 unida a rapamicina es una quinasa relacionada con fosfoinosítido 3-quinasa llamada FRAP (proteína asociada a FKBP-rapamicina) (10Brown e.j. Albers M.W. Shin T.B. Ichikawa K. Keith C.T. Lane W.S. Schreiber S.L. Nature. 1994; 369: 756-758Crossref PubMed Scopus (1661) Google Scholar), RAFT1 (rapamicina y FKBP12 objetivo 1) (11Sabatini D.M. Erdjument-Bromage H. Lui M. Tempst P. Snyder S.H. Cell. 1994; 78: 35-43Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1221) Google Scholar), or mTOR (mammalian target of rapamycin) (12Schmelzle T. Hall M.N. Cell. 2000; 103: 253-262Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1724) Google Scholar). Ni los fármacos inmunosupresores ni las inmunofilinas CyP-A y FKBP12 se unen solas a las segundas dianas proteicas para la inmunosupresión. Solo los complejos fármaco-inmunofilina se unen a la calcineurina o FRAP/RAFT1/mTOR. Aunque la mayor parte del trabajo sobre inmunofilinas se ha centrado en las pequeñas CyP y FKBP, como CyP-A y FKBP12, se han identificado inmunofilinas de alto peso molecular que contienen dominios para interacciones proteicas adicionales o actividad enzimática, así como un dominio de PPIasa que se une a fármacos inmunosupresores (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Varias de estas inmunofilinas de alto peso molecular se descubrieron como componentes de heterocomplejos de receptor de esteroides-hsp90. Incluyen CyP-40, FKBP51 y FKBP52 (revisado en la Ref. 13Pratt W.B. Toft D.O. Exp. Biol. Med. 2003; 228: 111-133Crossref PubMed Scopus (1260) Google Scholar), y no están involucrados en las acciones inmunosupresoras de CsA o FK506. Estas inmunofilinas poseen dominios de repetición de tetratricopéptido (TPR) que se unen a un sitio aceptor de TPR ubicado en el extremo C de la abundante y ubicua proteína chaperona hsp90. Se han propuesto dos funciones para estas inmunofilinas de unión a hsp90 en la acción del receptor de esteroides. Riggs et ál. (14Riggs D.L. Roberts P.J. Chirillo S.C. Cheung-Flynn J. Prapapanich V. Ratajczak T. Gaber R. Picard D. Smith D.F. EMBO J. 2003; 22: 1158-1167Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar) han demostrado que FKBP52 potencia selectivamente la activación del gen indicador dependiente del receptor de glucocorticoides (GR) al aumentar la afinidad de unión a hormonas del receptor. Este efecto requiere la actividad prolil isomerasa de FKBP52 y es bloqueado por FK506. Otra línea de investigación se ha centrado en el papel de las inmunofilinas de unión a hsp90 en la orientación del movimiento del GR al núcleo (revisado en la Ref. 15Pratt W.B. Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. Signal. 2004; 16: 857-872Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). La acción de estas inmunofilinas en el movimiento del receptor no se ve afectada por la presencia de fármacos inmunosupresores y, por lo tanto, no requiere actividad de prolil isomerasa. Además de las inmunofilinas de dominio TPR, los heterocomplejos GR·hsp90 inmunoadsorbidos de lisados celulares contienen dineína citoplasmática (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 17Davies T.H. Ning Y.M. Sanchez E.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 4597-4600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar), un motor molecular que se procesa a lo largo de pistas de microtúbulos hacia el núcleo (18Vallee R.B. Gee M.A. Trends Cell Biol. 1998; 8: 490-494Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). En estos complejos, el dominio PPIasa de la inmunofilina funciona como un dominio de unión proteína-proteína para unir la unidad GR·hsp90 al motor proteico (19Silverstein A.M. Galigniana M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 36980-36986Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. Galigniana M.D. Biochemistry. 2002; 41: 5581-5587Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002; 41: 13602-13610 Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). El enlace de inmunofilina a la dineína citoplasmática es indirecto por medio del componente dinamitina del complejo dinactina asociado a dineína (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). La unión de CyP-40 o FKBP52 a dineína compite con un fragmento de dominio PPIasa purificado de FKBP52 (21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002; 41: 13602-13610 Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar), y se ha demostrado que FKBP52 purificado se une directamente a través de su dominio PPIasa a dinamitina inmunopurificada (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). Existe un alto grado de similitud en la estructura del dominio PPIasa entre las diversas ciclofilinas (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). El dominio PPIasa de CyP-40 bovino, por ejemplo, comparte el 61% de identidad con la secuencia de CyP-A humana,y con una excepción, los residuos del sitio activo son idénticos (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Por lo tanto, nos hemos preguntado si CyP-A, como su homólogo de unión a hsp90 de alto peso molecular CyP-40, se une a través de su dominio PPIasa al complejo dineína/dinactina. Aquí mostramos que la inmunoadsorción de CyP-A a partir de lisado de reticulocitos o citosol de células L produce coinmunoadsorción de dineína citoplasmática. El enlace a la dineína es indirecto a través del componente de dinamitina del complejo de dinactina asociado a la dineína, y CyP-A se une a la dinamitina de una manera que compite con un fragmento de dominio PPIasa purificado de FKBP52. La inmunoprecipitación de CyP-A del citosol que contiene paclitaxel y GTP para estabilizar los microtúbulos produce la coprecipitación de tubulina y dineína de una manera dependiente del dominio PPIasa, y Cyp-A se colocaliza con los microtúbulos en las células NIH 3T3. La constatación de que CyP-A está asociada con el complejo de proteínas motoras dineína/dinactina a base de microtúbulos debería ser útil para definir eventualmente la (s) función(es) de mantenimiento de esta inmunofilina de dominio único en células de mamífero en ausencia de fármacos inmunosupresores. Materiales - El lisado de reticulocitos de conejo era de Green Hectares (Oregon, WI). La mezcla completa del inhibidor de la mini proteasa se adquirió de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). El medio de transfección Opti-MEM I fue de Invitrogen. El reactivo de transfección Trans-Fast era de Promega (Madison, WI). Los reactivos de quimioluminiscencia potenciados eran de Amersham Biosciences. Se adquirieron de Sigma glutatión-agarosa, proteína A-Sepharose, geldanamicina, hirudina, CsA, paclitaxel, IgG monoclonal de rata contra α-tubulina, IgG monoclonal de ratón contra GST y anticuerpos de burro anti-ratón y conejo anti-rata conjugados con peroxidasa de rábano picante. La IgG policlonal de conejo A-14 contra el oligopéptido c-myc era de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los contraanticuerpos fluorescentes eran de Immuno-Chemicals (West Grove, PA). Las células de Escherichia coli competentes para BL21 e IgG anti-conejo de cabra conjugadas con peroxidasa de rábano picante eran de Pierce. El antisuero policlonal de conejo contra CyP-A se preparó en el laboratorio de Scripps mediante inmunización con proteína CyP-A humana recombinante (23Saphire A.C. Bobardt M.D. Gallay P.A. EMBO J. 1999; 18: 6771-6785Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar). La IgG monoclonal de ratón contra la cadena intermedia de 74 kDa de dineína citoplasmática de mamífero se adquirió de Chemicon (Temecula, CA). El plásmido pGEX1λT que codifica el vector de expresión GST-conejo FKBP52 Gly32-Lys138 que comprende el dominio central I de PPIasa (proporcionado por los doctores Michel Renoir y Christine Radanyi, UMR8612 CNRS, París, Francia) y la purificación de la proteína del dominio central I de PPIasa se describieron previamente (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). El plásmido pECFP-N1 para expresar la proteína fluorescente de cianina fue proporcionado por el Dr. Rainer Benndorf (Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI). El baculovirus para el dominio TPR etiquetado con flag de la proteína fosfatasa 5 de rata (24Chen M.S. Silverstein A.M. Pratt W.B. Chinkers M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32315-32320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar) fue proporcionado amablemente por el Dr. Michael Chinkers (Universidad del Sur de Alabama, Mobile, AL). La construcción pCMVH50m etiquetada con myc que codifica p50/dinamitina (25Burkhardt J.K. Echeverri C.J. Nilsson T. Vallee R.B. J. Cell Biol. 1997; 139: 469-484Crossref PubMed Scopus (556) Google Scholar) fue un amable regalo del Dr. Richard Vallee (Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Worcester, MA). El plásmido pGEX-2T que codifica GST-CyP-A fue un amable regalo del Dr. Jeremy Luban (Universidad de Columbia) (26Luban J. Bossolt K.L. Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993; 73: 1067-1078Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar). Todos los tampones de incubación utilizados en estos estudios se complementaron con inhibidores de proteasa (1 comprimido de Complete Mini Plus 1000 unidades de hirudina/2 ml de tampón). La coinmunoadsorción de CyP-A endógena y dineína-50 μl de lisado de reticulocitos se inmunoadsorbió en 16 μl de proteína A-Sepharose con 5 μl de antisuero de conejo contra CyP-A o 5 μl de IgG de ratón contra la cadena intermedia de dineína. Después de 2 h a 4 °C, los sedimentos se lavaron con tampón TEGM (tes 10 mm a pH 7,6, NaCl 50 mm, EDTA 4 mm, glicerol al 10% v/v y Na2MoO4 20 mm). Las proteínas se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se electrotransfirieron a una membrana Immobilon P y se sometieron a transferencia Western. La formación de complejos con GST-CyP A—80 μl de GSH-agarosa inmovilizada en GSH-agarosa en 80 μl de amortiguador TEG (amortiguador TEGM sin molibdato) se incubó a 4 °C durante 2 h con 10 μl de citosol de E. coli BL21 que sobreexpresaba GST humana o GST-CyP-A humana. Los sedimentos se lavaron y se reincubaron durante dos horas adicionales en amortiguador TEG complementado con NaCl 0.5 m y Nonidet P-40 al 0.05% y se lavaron tres veces con amortiguador TEG y dos veces con Hepes de 10 mm a pH 7.5. Los sedimentos lavados que contenían GST-CyP-A inmovilizado (o GST solo) se incubaron durante 30 min a 30 °C con 50 μl de lisado de reticulocitos complementado con inhibidores de proteasa, 5 μl de un sistema de regeneración de ATP (ATP 50 mm, fosfato de creatina 250 mm, acetato de magnesio 20 mm y 100 unidades/ml de creatina fosfoquinasa) y los péptidos indicados en tampón HKD (Hepes 10 mm a pH 7,5, KCl 100 mm y ditiotreitol 2 mm). La unión de CyP-A a los fibroblastos de ratón Dynamitin-L929 se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero de ternera bovina al 10% y antibióticos. Cuando las células tenían una confluencia del 50%, el medio se reemplazó por medio de transfección Opti-MEM I y la incubación continuó durante 1 h. El medio se aspiró y se reemplazó por una mezcla de transfección (a una relación de 3 μl de liposoma/μg de ADN) preincubada durante 15 min a temperatura ambiente en Opti-MEM I, que contenía 3 μg del plásmido pCMVH50m etiquetado con myc que codifica p50/dinamitina. Después de 1,5 h de transfección, la mezcla se reemplazó por medio regular. Después de 36 h, las células se cosecharon y se rompieron mediante homogeneización Dounce en tampón HE (Hepes 10 mm a pH 7,5, EDTA 1 mm e inhibidores de proteasa) y se centrifugaron a 100.000 × g durante 30 min. El citosol celular (250 μl) se hizo girar durante 2 h a 4 °C con 16 μl de proteína A-Sepharose y 10 μl de anticuerpo anti-myc. El sobrenadante se aspiró y el sedimento se despojó de proteínas coinmunoadsorbidas mediante preincubación con amortiguador suplementado con NaCl 0.5 m y Nonidet P-40 al 0.05%. Después de 2 h, las muestras se lavaron tres veces con tampón TEG y dos veces con tampón HE. Los sedimentos se incubaron en hielo con 10 μl de lisado bacteriano que sobreexpresaba GST-CyP-A en presencia o ausencia de 90 μg de dominio PPIasa purificado de FKBP52. El volumen final se ajustó a 50 μl con tampón HKD. Después de 1 h, los sedimentos se lavaron con amortiguador TEGM y las proteínas se resolvieron mediante electroforesis seguida de transferencia Western. Preparaciones estabilizadas con microtúbulos: los fibroblastos L929 se incubaron durante 15 minutos con paclitaxel de 20 μm antes de la ruptura mediante homogeneización Dounce en amortiguador mes (0.1 m Mes, 1 mm EGTA y 1 mm MgCl2, pH 6.9) complementado con paclitaxel de 20 μm, 100 μm GTP e inhibidores de proteasa. Antes de la adsorción, se añadió Nonidet P-40 al 0.05% al citosol y se hizo girar durante 30 min a 4 °C y luego se centrifugó a 30 p.s.i. durante 15 min en un Airfuge. Se incubaron alícuotas (250 μl) de citosol a 30 °C durante 30 min con 25 μl de lisado de bacterias que no expresan y 50 μl de amortiguador HKD o 25 μl de lisado de bacterias que sobreexpresan GST-CyP-A y 50 μl de amortiguador HKD o 25 μl de lisado de bacterias que sobreexpresan GST-CyP-A y 325 μg de dominio PPIasa purificado de FKBP52 en amortiguador HKD. El amortiguador HKD también contenía inhibidores de proteasa. A continuación, se inmovilizó GST-CyP-A mediante rotación con GSH-agarosa durante 2 h a 4 °C. Los sedimentos se lavaron con amortiguador TEGM y las proteínas se resolvieron mediante inmunotransferencia. Inmunotransferencia: los sedimentos inmunes se resolvieron en geles de SDS-poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas Immobilon P. Las membranas se sondaron con 0,1% de MAB1618 para la cadena intermedia de dineína, 0,1% de A-14 para myc-dinamitina, 0,05% de antisuero de conejo para CyP-A y 0,05% de IgG de ratón para GST. Inmunofluorescencia indirecta: se cultivaron células NIH 3T3 en cubreobjetos de 11 × 22 mm recubiertos con fibrinógeno en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero de ternera bovina al 10% y antibióticos. Los cubreobjetos se enjuagaron con solución salina de fosfato y se fijaron durante 4 h en una solución de p-formaldehído al 4% recién preparada en tampón fosfato-salino. Las células se permeabilizaron sumergiendo los cubreobjetos en acetona a -20 °C durante 15 min. Después de lavar los cubreobjetos con tampón fosfato-salino, se preincubaron durante 1 h a temperatura ambiente en tampón HISS (solución de alta fuerza iónica) (Tris 20 mm a pH 8,0, NaCl 0,63 m, Tween 20 al 0,1% y albúmina de suero bovino al 3,5%) suplementado con suero de caballo al 1%. Las células se lavaron en tampón HISS y se inmunotiñeron invirtiendo los cubreobjetos en una solución de 50 μl de tampón HISS que contenía 1 μl de anti-α-tubulina de rata y 0,2 μl de suero anti-CyP-A de conejo. Después de 2 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda, las células se lavaron en tampón HISS durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron con una dilución 1/100 de los contraanticuerpos correspondientes (IgG de burro anti-conejo conjugado con rodamina e IgG de burro anti-rata conjugado con isotiocianato de fluoresceína). Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de microscopio usando una gota de medio de montaje Antifade (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos), y las células se observaron con un microscopio confocal Olympus Fluo-view-500. CyP-A se recupera en heterocomplejo nativo con dineína: para determinar si CyP-A existe en heterocomplejos nativos con dineína, el lisado de reticulocitos se inmunoadsorbió con anticuerpos dirigidos contra la inmunofilina o contra la cadena intermedia de dineína y las proteínas asociadas con los sedimentos inmunitarios lavados se detectaron mediante inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig. 1A, la inmunoadsorción de dineína produjo la coadsorción de CyP-A (carril 3) y la inmunoadsorción de CyP-A produjo la coadsorción de dineína (carril 5), consistente con la noción de que CyP-A existe en heterocomplejos nativos con dineína citoplasmática. En la Fig. 1, carriles 6-9, los carriles completos para cada inmunopellet se transfirieron con cada anticuerpo para demostrar la especificidad de la interacción. Para demostrar que el complejo no implica solo pequeñas cantidades de ninguna de las proteínas, se inmunoadsorbió una gran cantidad de CyP-A del lisado de reticulocitos y se evaluó la inmunodepleción de dineína resultante. Como se muestra en la Fig. 1B, el aumento de la inmunoadsorción de CyP-A estuvo acompañado por el aumento de la coadsorción de dineína (carriles 3 y 4). A la mayor cantidad de anticuerpo, la mayor parte de la CyP-A y una cantidad sustancial de la dineína se adsorbieron del lisado de reticulocitos (cf. carril 7 con carril 5). Al escanear los carriles con un PhosphorImager y restar un valor de fondo adyacente, se determinaron unidades arbitrarias para cada proteína restante en el sobrenadante no inmune (carril 5) y el sobrenadante inmune más alto (carril 7). Un agotamiento del 75% de CyP-A produjo un 59% de codepleción de dineína, lo que indica que la mayoría de cada proteína se encuentra en un heterocomplejo que contiene la otra proteína. Para demostrar que la unión no es una interacción débil y posiblemente inespecífica, el lisado de reticulocitos se inmunoadsorbió con anti-CyP-A y los sedimentos inmunitarios se lavaron en condiciones cada vez más duras. Como se muestra en la Fig. 1C, el complejo de CyP-A con dineína persistió tras el lavado con amortiguador TEG más NaCl 100 mm (cf. carriles 2 y 3) y el lavado con TEG más NaCl y Nonidet P-40 al 0.1% (carril 3). El lavado en condiciones detergentes muy duras (NaCl, Nonidet P-40, desoxicolato al 0,5% y dodecilsulfato de sodio al 1%) disocia el anticuerpo CyP-A del sedimento de proteína A-Sepharose de modo que se pierde la mayor parte de CyP-A y dineína. Sin embargo, se puede ver algún complejo de CyP-A y dineína en estas condiciones de lavado muy duras (carril 5). Anteriormente hemos utilizado lisado de reticulocitos para lograr un ensamblaje libre de células de complejos GR·hsp90 que contienen inmunofilinas de unión a hsp90 y dineína (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). En el experimento de la Fig. 2, GST-CyP-A se inmovilizó en perlas de glutatión y las perlas se incubaron con lisado de reticulocitos en las mismas condiciones de ensamblaje del heterocomplejo GR. Las perlas de glutatión unidas con GST sola no contenían dineína después de la incubación con lisado de reticulocitos (carril 2), pero las perlas unidas a GST-CyP-A contenían dineína (carril 5). Se requiere el dominio CyP-A PPIasa para el complejo con dineína: la formación de heterocomplejos que contienen las inmunofilinas y dineína de unión a hsp90 requiere el dominio PPIasa de la inmunofilina y puede bloquearse por competencia con el fragmento de dominio PPIasa de FKBP52 (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 19Silverstein A.M. Galigniana M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 36980-36986Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. Galigniana M.D. Biochemistry. 2002; 41: 5581-5587Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002; 41: 13602-13610 Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). En el experimento de la Fig. 3, las perlas unidas a GST-CyP-A se incubaron con lisado de reticulocitos en presencia de lisado de bacterias que expresan el fragmento de dominio PPIasa FKBP52 y las perlas se lavaron y analizaron para determinar las proteínas unidas. La presencia del fragmento de dominio PPIasa impidió la asociación de CyP-A con dineína (cf. carriles 2 y 4), mientras que la presencia de un fragmento de dominio TPR no afectó la unión de dineína (carril 5). Hemos demostrado previamente que el fragmento de dominio TPR inhibe la unión de inmunofilinas de dominio TPR a hsp90 pero no afecta su unión a dineína (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). Es importante destacar que CsA no afecta la formación de un complejo CyP-A con dineína (carril 6), lo que sugiere que no se requiere actividad de prolil isomerasa. Interacción de CyP-A con dinamitina: recientemente, hemos demostrado que la FKBP52 purificada se une directamente a la myc-dinamitina purificada, un componente de 50 kDa del complejo de dinactina asociado a la dineína (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). En la Fig. 4, el anticuerpo anti-myc se utilizó para inmunoadsorber el citosol de las células que sobreexpresan myc-dinamitina y el sedimento inmune despojado de sal se incubó con lisado de bacterias que expresan GST-CyP-A. El GST-CyP-A se unió a myc-dinamitina (condición 2), y la unión fue bloqueada por el fragmento de PPIasa de FKBP52 (condición 3). Por lo tanto, de manera similar a las inmunofilinas de unión a hsp90, CyP-A parece asociarse con dineína indirectamente al unirse a dinamitina. La tubulina está presente en los heterocomplejos CyP-A: recientemente hemos demostrado que los heterocomplejos GR inmunoadsorbidos del citosol de células L preparados con un tampón estabilizador de microtúbulos contienen tubulina y dineína. 2J. M. Harrell, M. D. Galigniana, P. J. M. Murphy, Y. Morishima y W. B. Pratt, manuscrito en preparación. En el experimento de la Fig. 5, las células L se trataron brevemente con paclitaxel y luego se rompieron en amortiguador que contenía paclitaxel y GTP para estabilizar los microtúbulos. El citosol también se preparó sin las condiciones de estabilización de microtúbulos. Se añadió lisado de bacterias que expresan GST-CyP-A a cada preparación de citosol, la mezcla se incubó y la GST-CyP-A se adsorbió en perlas de glutatión. Como se muestra en la Fig. 5, condición 2, la dineína está presente en los gránulos de GST-CyP-A preparados en cualquiera de las condiciones, pero la tubulina está presente solo cuando GST-CyP-A se adsorbe del citosol preparado en condiciones de estabilización de microtúbulos. Si el fragmento del dominio PPIasa está presente para competir por la unión de CyP-A a la dinamitina, ni la dineína ni la tubulina están presentes en el sedimento de GST-CyP-A (condición 3). Este hallazgo respalda un modelo en el que CyP-A está vinculado a los microtúbulos a través de su asociación con el complejo dineína/dinactina. CyP-A se localiza en microtúbulos en Vivo—In Fig. 6, los fibroblastos de ratón 3T3 se cotransfectaron con plásmidos que codifican el fragmento del dominio PPIasa de FKBP52 y la proteína fluorescente de cianina. Después de 36 h, las células se fijaron y se inmunotiñeron para tubulina (Fig. 6A, verde) y CyP-A (Fig. 6B, rojo). En las células no transfectadas, se observa que CyP-A se colocaliza con tubulina (ver fusión en la Fig. 6C). La imagen azul en la Fig. 6D muestra una célula cotransfectada en el medio del campo. La expresión del fragmento del dominio PPIasa no afectó el patrón fibrilar de los microtúbulos (Fig. 6A), pero interrumpió la distribución fibrilar de CyP-A (Fig. 6B). Esto es consistente con el fragmento del dominio PPIasa que compite por la localización de CyP-A en los microtúbulos. Aquí, hemos demostrado que la inmunofilina de dominio único, CyP-A, se comporta como las inmunofilinas de dominio TPR de unión a hsp90 en la unión al complejo de proteína motora de dineína citoplasmática (Fig. 1). El fragmento de dominio PPIasa de FKBP52 compite por la unión a dineína; sin embargo, en la medida en que la unión se produce en presencia o ausencia de CsA (Fig. 3), no se requiere la actividad isomerasa de CyP-A. Por lo tanto, la unión de los dominios de inmunofilina PPIasa al complejo de proteína motora es muy diferente de la unión de CyP-A o FKBP12 a calcineurina, donde solo la inmunofilina unida a CsA o FK506 es un compañero de unión de calcineurina. De nuevo, al igual que las inmunofilinas de unión a hsp90, CyP-A parece unirse a la dineína indirectamente a través de una interacción de su dominio PPIasa con el componente dinamitina del complejo dinactina asociado a dineína (Fig. 4). Los motores de dineína citoplasmática se procesan a lo largo de las vías de los microtúbulos, y mostramos que los heterocomplejos de CyP-A que contienen tubulina y dineína se pueden formar en el citosol en condiciones de estabilización de microtúbulos (Fig. 5). Es importante destacar que mostramos que CyP-A se colocaliza con microtúbulos en fibroblastos de ratón 3T3 y que la unión a microtúbulos in vivo se interrumpe por la sobreexpresión del fragmento del dominio PPIasa de FKBP52 (Fig. 6). En conjunto, las observaciones in vitro e in vivo respaldan un modelo en el que CyP-A se asocia con el sistema de movimiento retrógrado como un complejo CyP-A-dinamitina-dineína-microtúbulo. CyP-A está presente como una proteína relativamente abundante en el citoplasma de todas las células de mamífero (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Por lo tanto, debe realizar algunas funciones generales de limpieza importantes para la homeostasis celular. Hasta la fecha, los estudios de CyP-A se han centrado en gran medida en su estructura y su acción inmunosupresora a través de la asociación del complejo CyP-A ·CsA con calcineurina (1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1315-1347Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar, 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Informes ocasionales han señalado la asociación de CyP-A con proteínas específicas, como el supresor YY1 de la transcripción génica (27Yang W.M. Inouye C.J. Seto E.J. Biol. Chem. 1995; 270: 15187-15193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar) y el virus de la inmunodeficiencia humana, precursor de la poliproteína Pr55gag tipo 1 (26Luban J. Bossolt K.L. Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993; 73: 1067-1078Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar, 28Yoo S. Myszka D.G. Yeh C.Y. McMurray M. Hill C.P. Sundquist W.I. J. Mol. Biol. 1997; 269: 780-795Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Sin embargo, las asociaciones informadas no han llevado a un modelo general para la función de CyP-A en células de mamíferos en ausencia de CsA. La asociación de CyP-A con el complejo de proteínas motoras dineína/dinactina podría revelar una función de limpieza general. Se cree que la dineína se vincula a su carga indirectamente a través de la dinactina, pero no se sabe cómo se reconoce la carga (29 Hirokawa N. Science. 1998; 279: 519-526 Crossref PubMed Scopus (1369) Google Scholar). Resumimos en la Introducción cómo las inmunofilinas del dominio TPR se dirigen a dos proteínas reguladas por hsp90, la GR y la p53, al complejo dineína/dinactina para su movimiento retrógrado al núcleo (15Pratt W.B. Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. Signal. 2004; 16: 857-872Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). CyP-A podría participar en dicho reconocimiento de carga directa o indirectamente como parte de un complejo proteico. Curiosamente, hay varias líneas de evidencia que sugieren que el VIH utiliza la dineína y la red de microtúbulos para transportar su genoma al núcleo. Porque el VIH requiere que CyP-A se replique eficientemente en células humanas (30FRANKE E.K. Yuan H.E Luban J. Nature. 1994; 372: 359-362Crossref PubMed Scopus (645) Google Scholar, 31Thali M. Bukovsky A. Kondo E. Rosenwirth B. Walsh C.T. Sodroski J. Gottlinger H.G. Nature. 1994; 372: 363-365Crossref PubMed Scopus (559) Google Scholar), se puede prever que CyP-A actúa como conector entre el VIH y la red de microtúbulos para facilitar un transporte seguro del genoma viral al núcleo. Agradecemos a Rainer Benndorf, Michael Chinkers, Jeremy Luban, Christine Radanyi, Michel Renoir y Richard Vallee por proporcionar los reactivos utilizados en este trabajo.

Although cyclophilin A (CyP-A) is a relatively abundant small immunophilin present in the cytoplasm of all mammalian cells, its general function(s) in the absence of the immunosuppressant drug cyclosporin A is not known. In contrast, the high molecular weight hsp90-binding immunophilins appear to play a role in protein trafficking in that they have been shown to link glucocorticoid receptor-hsp90 and p53·hsp90 complexes to the dynein motor protein for retrograde movement along microtubules. These immunophilins link to cytoplasmic dynein indirectly through the association of the immunophilin peptidylprolyl isomerase (PPIase) domain with dynamitin, a component of the dynein-associated dynactin complex (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., Ljungman, M., and Pratt, W. B. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22483-22489). Here, we show that CyP-A exists in native heterocomplexes containing cytoplasmic dynein that can be formed in cell-free systems. Prolyl isomerase activity is not required for forming the dynein complex, but the PPIase domain fragment of FKBP52 blocks complex formation and CyP-A binds to dynamitin in a PPIase domain-dependent manner. CyP-A heterocomplexes containing tubulin and dynein can be formed in cytosol prepared under microtubule-stabilizing conditions, and CyP-A colocalizes in mouse fibroblasts with microtubules. Colocalization with microtubules is disrupted by overexpression of the PPIase domain fragment. Thus, we conclude that CyP-A associates in vitro and in vivo with the dynein/dynactin motor protein complex and we suggest that CyP-A may perform a general function related to the binding of cargo for retrograde movement along microtubules. Although cyclophilin A (CyP-A) is a relatively abundant small immunophilin present in the cytoplasm of all mammalian cells, its general function(s) in the absence of the immunosuppressant drug cyclosporin A is not known. In contrast, the high molecular weight hsp90-binding immunophilins appear to play a role in protein trafficking in that they have been shown to link glucocorticoid receptor-hsp90 and p53·hsp90 complexes to the dynein motor protein for retrograde movement along microtubules. These immunophilins link to cytoplasmic dynein indirectly through the association of the immunophilin peptidylprolyl isomerase (PPIase) domain with dynamitin, a component of the dynein-associated dynactin complex (Galigniana, M. D., Harrell, J. M., O'Hagen, H. M., Ljungman, M., and Pratt, W. B. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22483-22489). Here, we show that CyP-A exists in native heterocomplexes containing cytoplasmic dynein that can be formed in cell-free systems. Prolyl isomerase activity is not required for forming the dynein complex, but the PPIase domain fragment of FKBP52 blocks complex formation and CyP-A binds to dynamitin in a PPIase domain-dependent manner. CyP-A heterocomplexes containing tubulin and dynein can be formed in cytosol prepared under microtubule-stabilizing conditions, and CyP-A colocalizes in mouse fibroblasts with microtubules. Colocalization with microtubules is disrupted by overexpression of the PPIase domain fragment. Thus, we conclude that CyP-A associates in vitro and in vivo with the dynein/dynactin motor protein complex and we suggest that CyP-A may perform a general function related to the binding of cargo for retrograde movement along microtubules. The cyclophilins (CyPs) 1The abbreviations used are: CyP, cyclophilin; CyP-A, cyclophilin-A; PPIase, peptidylprolyl isomerase; FKBP, FK506-binding protein; hsp, heat shock protein; CsA, cyclosporin A; CyP-40, cyclophilin 40; TPR, tetratricopeptide repeat; GR, glucocorticoid receptor; GST, glutathione S-transferase; GSH, glutathione; DIC, dynein intermediate chain; TES, 2-{[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino}ethanesulfonic acid; Mes, 4-morpholineethanesulfonic acid; HISS, high ionic strength solution; HIV, human immunodeficiency virus.1The abbreviations used are: CyP, cyclophilin; CyP-A, cyclophilin-A; PPIase, peptidylprolyl isomerase; FKBP, FK506-binding protein; hsp, heat shock protein; CsA, cyclosporin A; CyP-40, cyclophilin 40; TPR, tetratricopeptide repeat; GR, glucocorticoid receptor; GST, glutathione S-transferase; GSH, glutathione; DIC, dynein intermediate chain; TES, 2-{[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino}ethanesulfonic acid; Mes, 4-morpholineethanesulfonic acid; HISS, high ionic strength solution; HIV, human immunodeficiency virus. are members of a large protein family called immunophilins because of their ability to bind immunosuppressant drugs (reviewed in Refs. 1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1315-1347Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar and 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). The cyclophilins bind the drug cyclosporin A (CsA), and a second class of immunophilins, the FK506-binding proteins (FKBPs), binds the immunosuppressant drugs FK506 and rapamycin. The immunophilins possess peptidylprolyl isomerase (PPIase) activity, and the immunosuppressant drugs occupy the PPIase site on the immunophilin, blocking its ability to direct cistrans-isomerization of peptidylprolyl bonds in vitro. CyP-A was isolated as a 17-kDa high affinity binding protein for cyclosporin A (3Handschumacher R.E. Harding M.W. Rice J. Drugge R.J. Speicher D.W. Science. 1984; 226: 544-547Crossref PubMed Scopus (1452) Google Scholar), and it was later shown to be the same as a 17-kDa protein (4Fischer G. Wittmann-Liebold B. Lang K. Kiefhaber T. Schmid F.X. Nature. 1989; 337: 476-478Crossref PubMed Scopus (1209) Google Scholar, 5Takahashi N. Hayano T. Suzuki M. Nature. 1989; 337: 473-475Crossref PubMed Scopus (939) Google Scholar) that was known to have PPIase activity and to accelerate refolding of urea-denatured protein in vitro (6Fischer G. Bang H. Biochim. Biophys. Acta. 1985; 828: 39-42Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar). CyP-A was subsequently shown to direct the immunosuppressive effect of CsA (7Liu J. Immunol. Today. 1993; 14: 290-295Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar), and the small FKBP, FKBP12, was shown to be the target for the immunosuppressive effects of FK506 and rapamycin (8Bierer B.E. Mattila P.S. Standaert R.F. Herzenberg L.A. Burakoff S.J. Crabtree G. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 9231-9235Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). In both the case of CsA-bound CyP-A and that of FK506-bound FKBP12, the ultimate target of the drug-immunophilin complex is the protein phosphatase calcineurin (for review see Ref. 9Ivery M.T. Med. Res. Rev. 2000; 20: 452-484Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). The ultimate target for rapamycin-bound FKBP12 is a phosphoinositide 3-kinase-related kinase called FRAP (FKBP-rapamycin-associated protein) (10Brown E.J. Albers M.W. Shin T.B. Ichikawa K. Keith C.T. Lane W.S. Schreiber S.L. Nature. 1994; 369: 756-758Crossref PubMed Scopus (1661) Google Scholar), RAFT1 (rapamycin and FKBP12 target 1) (11Sabatini D.M. Erdjument-Bromage H. Lui M. Tempst P. Snyder S.H. Cell. 1994; 78: 35-43Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1221) Google Scholar), or mTOR (mammalian target of rapamycin) (12Schmelzle T. Hall M.N. Cell. 2000; 103: 253-262Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1724) Google Scholar). Neither the immunosuppressant drugs nor the immunophilins CyP-A and FKBP12 bind alone to the second protein targets for immunosuppression. Only the drug-immunophilin complexes bind to calcineurin or FRAP/RAFT1/mTOR. Although most of the work on immunophilins has focused on the small CyPs and FKBPs, like CyP-A and FKBP12, high molecular weight immunophilins have been identified that contain domains for additional protein interactions or enzymatic activity as well as a PPIase domain that binds immunosuppressant drugs (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Several of these high molecular weight immunophilins were discovered as components of steroid receptor-hsp90 heterocomplexes. They include CyP-40, FKBP51, and FKBP52 (reviewed in Ref. 13Pratt W.B. Toft D.O. Exp. Biol. Med. 2003; 228: 111-133Crossref PubMed Scopus (1260) Google Scholar), and they are not involved in the immunosuppressant actions of CsA or FK506. These immunophilins possess tetratricopeptide repeat (TPR) domains that bind to a TPR acceptor site located in the C terminus of the abundant and ubiquitous protein chaperone hsp90. Two roles have been proposed for these hsp90-binding immunophilins in steroid receptor action. Riggs et al. (14Riggs D.L. Roberts P.J. Chirillo S.C. Cheung-Flynn J. Prapapanich V. Ratajczak T. Gaber R. Picard D. Smith D.F. EMBO J. 2003; 22: 1158-1167Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar) have shown that FKBP52 selectively potentiates glucocorticoid receptor (GR)-dependent reporter gene activation by increasing the hormone-binding affinity of the receptor. This effect requires the prolyl isomerase activity of FKBP52 and is blocked by FK506. Another line of research has focused on the role of hsp90-binding immunophilins in targeting the movement of the GR to the nucleus (reviewed in Ref. 15Pratt W.B. Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. Signal. 2004; 16: 857-872Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). The action of these immunophilins in receptor movement is not affected by the presence of immunosuppressant drugs and thus does not require prolyl isomerase activity. In addition to TPR domain immunophilins, GR·hsp90 heterocomplexes immunoadsorbed from cell lysates contain cytoplasmic dynein (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 17Davies T.H. Ning Y.M. Sanchez E.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 4597-4600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar), a molecular motor that processes along microtubule tracks toward the nucleus (18Vallee R.B. Gee M.A. Trends Cell Biol. 1998; 8: 490-494Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). In these complexes, the PPIase domain of the immunophilin functions as a protein-protein-binding domain to link the GR·hsp90 unit to the protein motor (19Silverstein A.M. Galigniana M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 36980-36986Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. Galigniana M.D. Biochemistry. 2002; 41: 5581-5587Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002; 41: 13602-13610Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). The immunophilin linkage to cytoplasmic dynein is indirect by means of the dynamitin component of the dynein-associated dynactin complex (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). The binding of CyP-40 or FKBP52 to dynein is competed by a purified PPIase domain fragment of FKBP52 (21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002; 41: 13602-13610Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar), and purified FKBP52 has been shown to bind directly via its PPIase domain to immunopurified dynamitin (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). There is a high degree of similarity in PPIase domain structure among the various cyclophilins (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). The PPIase domain of bovine CyP-40, for example, shares 61% identity with the sequence of human CyP-A,and with one exception, the active site residues are identical (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Thus, we have asked whether CyP-A, like as its high molecular weight hsp90-binding homolog CyP-40, binds through its PPIase domain to the dynein/dynactin complex. Here we show that immunoadsorption of CyP-A from reticulocyte lysate or L cell cytosol yields coimmunoadsorption of cytoplasmic dynein. The linkage to dynein is indirect via the dynamitin component of the dynein-associated dynactin complex, and CyP-A binds to dynamitin in a manner that is competed by a purified PPIase domain fragment of FKBP52. Immunoprecipitation of CyP-A from cytosol containing paclitaxel and GTP to stabilize microtubules yields the coprecipitation of tubulin and dynein in a PPIase domain-dependent manner, and Cyp-A colocalizes with microtubules in NIH 3T3 cells. The observation that CyP-A is associated with the microtubule-based dynein/dynactin motor protein complex should be useful in eventually defining the housekeeping function(s) of this single domain immunophilin in mammalian cells in the absence of immunosuppressant drugs. Materials—Rabbit reticulocyte lysate was from Green Hectares (Oregon, WI). Complete Mini protease inhibitor mixture was purchased from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany). Opti-MEM I transfection medium was from Invitrogen. Trans-Fast transfection reagent was from Promega (Madison, WI). Enhance chemiluminescence reagents were from Amersham Biosciences. Glutathione-agarose, protein A-Sepharose, geldanamycin, hirudin, CsA, paclitaxel, rat monoclonal IgG against α-tubulin, mouse monoclonal IgG against GST, and the horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-mouse and rabbit anti-rat antibodies were purchased from Sigma. The A-14 rabbit polyclonal IgG against c-myc oligopeptide was from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Fluorescent counterantibodies were from Immuno-Chemicals (West Grove, PA). Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG and BL21-competent Escherichia coli cells were from Pierce. The rabbit polyclonal antiserum against CyP-A was prepared in the Scripps laboratory by immunization with recombinant human CyP-A protein (23Saphire A.C. Bobardt M.D. Gallay P.A. EMBO J. 1999; 18: 6771-6785Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar). The mouse monoclonal IgG against the 74-kDa intermediate chain of mammalian cytoplasmic dynein was purchased from Chemicon (Temecula, CA). The pGEX1λT plasmid encoding the GST-rabbit FKBP52 Gly32-Lys138 expression vector that comprises the PPIase core domain I (provided by Drs. Michel Renoir and Christine Radanyi, UMR8612 CNRS, Paris, France) and the purification of the PPIase core domain I protein were described previously (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). The pECFP-N1 plasmid for expressing cyanine fluorescent protein was provided by Dr. Rainer Benndorf (University of Michigan Medical School, Ann Arbor, MI). The baculovirus for the FLAG-tagged TPR domain of rat protein phosphatase 5 (24Chen M.S. Silverstein A.M. Pratt W.B. Chinkers M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32315-32320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar) was kindly provided by Dr. Michael Chinkers (University of South Alabama, Mobile, AL). The myc-tagged pCMVH50m construct encoding for p50/dynamitin (25Burkhardt J.K. Echeverri C.J. Nilsson T. Vallee R.B. J. Cell Biol. 1997; 139: 469-484Crossref PubMed Scopus (556) Google Scholar) was a kind gift from Dr. Richard Vallee (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA). The pGEX-2T plasmid encoding GST-CyP-A was a kind gift from Dr. Jeremy Luban (Columbia University) (26Luban J. Bossolt K.L. Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993; 73: 1067-1078Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar). All of the incubation buffers used in these studies were supplemented with protease inhibitors (1 tablet of Complete Mini Plus 1000 units of hirudin/2 ml of buffer). Coimmunoadsorption of Endogenous CyP-A and Dynein—50 μl of reticulocyte lysate were immunoadsorbed to 16 μl of protein A-Sepharose with either 5 μl of rabbit antiserum against CyP-A or 5 μl of mouse IgG against dynein intermediate chain. After 2 h at 4 °C, the pellets were washed with TEGM buffer (10 mm TES at pH 7.6, 50 mm NaCl, 4 mm EDTA, 10% v/v glycerol, and 20 mm Na2MoO4). Proteins were resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, electrotransferred to an Immobilon P membrane, and Western blotted. Formation of Complexes with GSH-Agarose-immobilized GST-CyP A—80 μl of GSH-agarose in 80 μl of TEG buffer (TEGM buffer without molybdate) were incubated at 4 °C for 2 h with 10 μl of cytosol from BL21 E. coli overexpressing either human GST or human GST-CyP-A. The pellets were washed and reincubated for two additional hours in TEG buffer supplemented with 0.5 m NaCl and 0.05% Nonidet P-40 and washed three times with TEG buffer and twice with 10 mm Hepes at pH 7.5. The washed pellets containing immobilized GST-CyP-A (or GST alone) were incubated for 30 min at 30 °C with 50 μl of reticulocyte lysate supplemented with protease inhibitors, 5 μl of an ATP-regeneration system (50 mm ATP, 250 mm creatine phosphate, 20 mm magnesium acetate, and 100 units/ml creatine phosphokinase), and the indicated peptides in HKD buffer (10 mm Hepes at pH 7.5, 100 mm KCl, and 2 mm dithiothreitol). Binding of CyP-A to Dynamitin—L929 mouse fibroblasts were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% bovine calf serum and antibiotics. When the cells were 50% confluent, the medium was replaced by Opti-MEM I transfection medium and the incubation continued for 1 h. The medium was aspirated and replaced by a transfection mixture (at a 3-μl liposome/μg DNA ratio) preincubated for 15 min at room temperature in Opti-MEM I, which contained 3 μg of the myc-tagged pCMVH50m plasmid encoding for p50/dynamitin. After 1.5 h of transfection, the mixture was replaced by regular medium. After 36 h, the cells were harvested and ruptured by Dounce homogenization in HE buffer (10 mm Hepes at pH 7.5, 1 mm EDTA, and protease inhibitors) and centrifuged at 100,000 × g for 30 min. Cell cytosol (250 μl) was rotated for 2 h at 4 °C with 16 μl of protein A-Sepharose and 10 μl of anti-myc antibody. The supernatant was aspirated, and the pellet was stripped of coimmunoadsorbed proteins by preincubation with buffer supplemented with 0.5 m NaCl and 0.05% Nonidet P-40. After 2 h, the samples were washed three times with TEG buffer and twice with HE buffer. The pellets were incubated on ice with 10 μl of bacterial lysate overexpressing GST-CyP-A in the presence or absence of 90 μg of purified PPIase domain from FKBP52. The final volume was adjusted to 50 μl with HKD buffer. After 1 h, the pellets were washed with TEGM buffer and the proteins were resolved by electrophoresis followed by Western blotting. Microtubule-stabilized Preparations—L929 fibroblasts were incubated for 15 min with 20 μm paclitaxel prior to rupture by Dounce homogenization in MES buffer (0.1 m Mes, 1 mm EGTA, and 1 mm MgCl2, pH 6.9) supplemented with 20 μm paclitaxel, 100 μm GTP, and protease inhibitors. Prior to adsorption, 0.05% Nonidet P-40 was added to the cytosol and it was rotated for 30 min at 4 °C and then centrifuged at 30 p.s.i. for 15 min in an Airfuge. Aliquots (250 μl) of cytosol were incubated at 30 °C for 30 min with 25 μl of lysate from nonexpressing bacteria and 50 μl of HKD buffer or 25 μl of lysate from bacteria overexpressing GST-CyP-A and 50 μl of HKD buffer or 25 μl of lysate from bacteria overexpressing GST-CyP-A and 325 μg of purified PPIase domain of FKBP52 in HKD buffer. The HKD buffer also contained protease inhibitors. GST-CyP-A was then immobilized by rotation with GSH-agarose for 2 h at 4 °C. The pellets were washed with TEGM buffer, and the proteins were resolved by immunoblotting Immunoblotting—Immune pellets were resolved on SDS-10% polyacrylamide gels and transferred to Immobilon P membranes. The membranes were probed with 0.1% MAB1618 for dynein intermediate chain, 0.1% A-14 for myc-dynamitin, 0.05% rabbit antiserum for CyP-A, and 0.05% mouse IgG for GST. Indirect Immunofluorescence—NIH 3T3 cells were grown on 11 × 22-mm coverslips coated with fibrinogen in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% bovine calf serum and antibiotics. The coverslips were rinsed with phosphate-saline solution and fixed for 4 h in a freshly prepared 4% p-formaldehyde solution in phosphate-saline buffer. Cells were permeabilized by immersing the coverslips in acetone at -20 °C for 15 min. After washing the coverslips with phosphate-saline buffer, they were preincubated for 1 h at room temperature in HISS (high ionic strength solution) buffer (20 mm Tris at pH 8.0, 0.63 m NaCl, 0.1% Tween 20, and 3.5% bovine serum albumin) supplemented with 1% horse serum. The cells were washed in HISS buffer and immunostained by inverting the coverslips on a 50-μl solution of HISS buffer containing 1 μl of rat anti-α-tubulin and 0.2 μl of rabbit anti-CyP-A serum. After 2 h at room temperature in a humid chamber, the cells were washed in HISS buffer for 1 h at room temperature and then incubated with a 1/100 dilution of the corresponding counter-antibodies (rhodamine-conjugated donkey anti-rabbit IgG and fluorescein isothiocyanate-conjugated donkey anti-rat IgG). The coverslips were mounted on microscope slides using a drop of Antifade mounting medium (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands), and the cells were observed with an Olympus Fluo-view-500 confocal microscope. CyP-A Is Recovered in Native Heterocomplex with Dynein—To determine whether CyP-A exists in native heterocomplexes with dynein, reticulocyte lysate was immunoadsorbed with antibodies directed against the immunophilin or against the intermediate chain of dynein and proteins associated with the washed immune pellets were detected by immunoblotting. As shown in Fig. 1A, immunoadsorption of dynein yielded coadsorption of CyP-A (lane 3) and immunoadsorption of CyP-A yielded coadsorption of dynein (lane 5), consistent with the notion that CyP-A exists in native heterocomplexes with cytoplasmic dynein. In Fig. 1, lanes 6-9, the entire lanes for each immunopellet were blotted with each antibody to demonstrate the specificity of the interaction. To show that the complex does not involve only small amounts of either protein, a large amount of CyP-A was immunoadsorbed from reticulocyte lysate and the resulting immunodepletion of dynein was assessed. As shown in Fig. 1B, increasing immunoadsorption of CyP-A was accompanied by increasing coadsorption of dynein (lanes 3 and 4). At the higher amount of antibody, most of the CyP-A and a substantial amount of the dynein were adsorbed from reticulocyte lysate (cf. lane 7 with lane 5). By scanning the lanes with a PhosphorImager and subtracting an adjacent background value, arbitrary units for each protein remaining in nonimmune (lane 5) and the highest immune (lane 7) supernatant were determined. A depletion of 75% CyP-A yielded 59% codepletion of dynein, indicating that a majority of each protein is in a heterocomplex containing the other protein. To show that the binding is not a weak and possibly nonspecific interaction, reticulocyte lysate was immunoadsorbed with anti-CyP-A and the immune pellets were washed under increasingly harsh conditions. As shown in Fig. 1C, the complex of CyP-A with dynein persisted upon washing with TEG buffer plus 100 mm NaCl (cf. lanes 2 and 3) and washing with TEG plus NaCl and 0.1% Nonidet P-40 (lane 3). Washing under very harsh detergent conditions (NaCl, Nonidet P-40, 0.5% deoxycholate, and 1% sodium dodecyl sulfate) dissociates the CyP-A antibody from the protein A-Sepharose pellet such that most of the CyP-A and dynein are lost. Nevertheless, some complex of CyP-A and dynein can be seen under these very harsh conditions of washing (lane 5). We have previously used reticulocyte lysate to achieve cell-free assembly of GR·hsp90 complexes that contain hsp90-binding immunophilins and dynein (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). In the experiment of Fig. 2, GST-CyP-A was immobilized onto glutathione beads and the beads were incubated with reticulocyte lysate under the same GR heterocomplex assembly conditions. Glutathione beads bound with GST alone did not contain dynein after incubation with reticulocyte lysate (lane 2), but GST-CyP-A-bound beads contained dynein (lane 5). CyP-A PPIase Domain Is Required for Complex with Dynein—The formation of heterocomplexes containing the hsp90-binding immunophilins and dynein requires the PPIase domain of the immunophilin and can be blocked by competition with the PPIase domain fragment of FKBP52 (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 19Silverstein A.M. Galigniana M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 36980-36986Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt W.B. Galigniana M.D. Biochemistry. 2002; 41: 5581-5587Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002; 41: 13602-13610Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). In the experiment of Fig. 3, GST-CyP-A-bound beads were incubated with reticulocyte lysate in the presence of lysate from bacteria expressing the FKBP52 PPIase domain fragment and the beads were then washed and assayed for bound proteins. The presence of the PPIase domain fragment prevented CyP-A association with dynein (cf. lanes 2 and 4), whereas the presence of a TPR domain fragment did not affect dynein binding (lane 5). We have shown previously that the TPR domain fragment inhibits the binding of TPR domain immunophilins to hsp90 but does not affect their binding to dynein (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). Importantly, CsA does not affect the formation of a CyP-A complex with dynein (lane 6), suggesting that prolyl isomerase activity is not required. CyP-A Interaction with Dynamitin—Recently, we have demonstrated that purified FKBP52 binds directly to purified myc-dynamitin, a 50-kDa component of the dynein-associated dynactin complex (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen H.M. Ljungman M. Pratt W.B. J. Biol. Chem. 2004; 279: 22483-22489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar). In Fig. 4, anti-myc antibody was used to immunoadsorb cytosol from cells overexpressing myc-dynamitin and the salt-stripped immune pellet was incubated with lysate from bacteria expressing GST-CyP-A. The GST-CyP-A bound to myc-dynamitin (condition 2), and the binding was blocked by the PPIase fragment of FKBP52 (condition 3). Thus, similar to the hsp90-binding immunophilins, CyP-A appears to associate with dynein indirectly by binding to dynamitin. Tubulin Is Present in the CyP-A Heterocomplexes—We have recently shown that GR heterocomplexes immunoadsorbed from L cell cytosol prepared with a microtubule-stabilizing buffer contain tubulin as well as dynein. 2J. M. Harrell, M. D. Galigniana, P. J. M. Murphy, Y. Morishima, and W. B. Pratt, manuscript in preparation. In the experiment of Fig. 5, L cells were treated briefly with paclitaxel and then ruptured in buffer containing both paclitaxel and GTP to stabilize microtubules. Cytosol was also prepared without the microtubule-stabilizing conditions. Lysate from bacteria expressing GST-CyP-A was added to each cytosol preparation, the mixture was incubated, and the GST-CyP-A was adsorbed to glutathione beads. As shown in Fig. 5, condition 2, dynein is present in GST-CyP-A pellets prepared under either condition but tubulin is present only when GST-CyP-A is adsorbed from cytosol prepared under microtubule-stabilizing conditions. If the PPIase domain fragment is present to compete for CyP-A binding to dynamitin, neither dynein nor tubulin is present in the GST-CyP-A pellet (condition 3). This finding supports a model in which CyP-A is linked to microtubules via its association with the dynein/dynactin complex. CyP-A Is Localized to Microtubules in Vivo—In Fig. 6, 3T3 mouse fibroblasts were cotransfected with plasmids encoding for the PPIase domain fragment of FKBP52 and cyanine fluorescent protein. After 36 h, the cells were fixed and immunostained for tubulin (Fig. 6A, green) and CyP-A (Fig. 6B, red). In the untransfected cells, CyP-A is seen to colocalize with tubulin (see merge in Fig. 6C). The blue image in Fig. 6D shows a cotransfected cell in the middle of the field. The expression of the PPIase domain fragment did not affect the fibrillar pattern of the microtubules (Fig. 6A), but it disrupted the fibrillar distribution of CyP-A (Fig. 6B). This is consistent with the PPIase domain fragment competing for the localization of CyP-A to microtubules. Here, we have shown that the single domain immunophilin, CyP-A, behaves like the hsp90-binding TPR domain immunophilins in binding to the cytoplasmic dynein motor protein complex (Fig. 1). The PPIase domain fragment of FKBP52 competes for dynein binding; however, inasmuch as binding occurs in the presence or absence CsA (Fig. 3), the isomerase activity of CyP-A is not required. Thus, the binding of immunophilin PPIase domains to the motor protein complex is very different from the binding of CyP-A or FKBP12 to calcineurin where only the CsA- or FK506-bound immunophilin is a calcineurin binding partner. Again, like the hsp90-binding immunophilins, CyP-A appears to bind to dynein indirectly through an interaction of its PPIase domain with the dynamitin component of the dynein-associated dynactin complex (Fig. 4). Cytoplasmic dynein motors process along microtubules tracks, and we show that CyP-A heterocomplexes containing tubulin and dynein can be formed in cytosol under microtubule-stabilizing conditions (Fig. 5). Importantly, we show that CyP-A colocalizes with microtubules in 3T3 mouse fibroblasts and that binding to microtubules in vivo is disrupted by overexpression of the PPIase domain fragment of FKBP52 (Fig. 6). Taken together, the in vitro and in vivo observations support a model in which CyP-A is associated with the retrograde movement system as a CyP-A-dynamitin-dynein-microtubule complex. CyP-A is present as a relatively abundant protein in the cytoplasm of all mammalian cells (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Thus, it must perform some general housekeeping function(s) important for cellular homeostasis. To date, the studies of CyP-A have largely focused on its structure and its immunosuppressive action through the association of the CyP-A·CsA complex with calcineurin (1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1315-1347Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar, 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Occasional reports have noted the CyP-A association with specific proteins, such as the YY1 suppressor of gene transcription (27Yang W.M. Inouye C.J. Seto E. J. Biol. Chem. 1995; 270: 15187-15193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar) and human immunodeficiency virus, type 1 Pr55gag polyprotein precursor (26Luban J. Bossolt K.L. Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993; 73: 1067-1078Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar, 28Yoo S. Myszka D.G. Yeh C.Y. McMurray M. Hill C.P. Sundquist W.I. J. Mol. Biol. 1997; 269: 780-795Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). However, the associations reported have not led to a general model for CyP-A function in mammalian cells in the absence of CsA. The association of CyP-A with the dynein/dynactin motor protein complex could reveal a general housekeeping function. Dynein is thought to link to its cargo indirectly through dynactin, but it is not known how cargo is recognized (29Hirokawa N. Science. 1998; 279: 519-526Crossref PubMed Scopus (1369) Google Scholar). We summarized in the Introduction how the TPR domain immunophilins target two hsp90-regulated proteins, the GR and p53, to the dynein/dynactin complex for their retrograde movement to the nucleus (15Pratt W.B. Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. Signal. 2004; 16: 857-872Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). CyP-A could participate in such cargo recognition either directly or indirectly as part of a protein complex. Interestingly, there are several lines of evidence suggesting that HIV uses dynein and the microtubule network to transport its genome to the nucleus. Because HIV requires CyP-A to efficiently replicate in human cells (30Franke E.K. Yuan H.E Luban J. Nature. 1994; 372: 359-362Crossref PubMed Scopus (645) Google Scholar, 31Thali M. Bukovsky A. Kondo E. Rosenwirth B. Walsh C.T. Sodroski J. Gottlinger H.G. Nature. 1994; 372: 363-365Crossref PubMed Scopus (559) Google Scholar), one can envision that CyP-A acts as connector between HIV and the microtubule network in order to facilitate a secured convey of the viral genome to the nucleus. We thank Rainer Benndorf, Michael Chinkers, Jeremy Luban, Christine Radanyi, Michel Renoir, and Richard Vallee for providing reagents used in this work.

على الرغم من أن السيكلوفيلين أ (CyP - A) عبارة عن مناعة صغيرة وفيرة نسبيًا موجودة في السيتوبلازم لجميع خلايا الثدييات، إلا أن وظيفتها(وظائفها) العامة في غياب عقار السيكلوسبورين أ المثبط للمناعة غير معروفة. في المقابل، يبدو أن الخلايا المناعية المرتبطة بالوزن الجزيئي العالي hsp90 تلعب دورًا في الاتجار بالبروتين حيث ثبت أنها تربط مستقبلات الكورتيكويد السكري - hsp90 و p53 · hsp90 بالبروتين الحركي الداينين للحركة الرجعية على طول الأنابيب الدقيقة. ترتبط هذه الخلايا المناعية بالداينين السيتوبلازمي بشكل غير مباشر من خلال ارتباط مجال إيزوميراز الببتيديل بروليل المناعي (PPIase) بالديناميتين، وهو مكون من مركب داينكتين المرتبط بالداين (Galigniana، MD، Harrell، JM، O'Hagen، HM، Ljungman، M.، and Pratt، WB (2004) J. Biol. كيم. 279، 22483-22489). هنا، نظهر أن CyP - A موجود في معقدات غير متجانسة أصلية تحتوي على داينين سيتوبلازمي يمكن تشكيله في أنظمة خالية من الخلايا. نشاط مصاوغات البروليل غير مطلوب لتشكيل مركب الداينين، لكن جزء مجال PPIase من FKBP52 يمنع التكوين المعقد ويرتبط CyP - A بالديناميتين بطريقة تعتمد على مجال PPIase. يمكن تشكيل معقدات CyP - A غير المتجانسة التي تحتوي على التوبولين والداينين في سيتوسول محضر في ظل ظروف تثبيت الأنابيب الدقيقة، ويتركز CyP - A في الخلايا الليفية للفأر مع الأنابيب الدقيقة. يتم تعطيل التوطين باستخدام الأنابيب الدقيقة بسبب الإفراط في التعبير عن جزء مجال PPIase. وبالتالي، فإننا نستنتج أن CyP - A يرتبط في المختبر وفي الجسم الحي بمركب البروتين الحركي للداينين/دايناكتين ونقترح أن CyP - A قد يؤدي وظيفة عامة تتعلق بربط البضائع للحركة الرجعية على طول الأنابيب الدقيقة. على الرغم من أن السيكلوفيلين أ (CyP - A) عبارة عن مناعة صغيرة وفيرة نسبيًا موجودة في السيتوبلازم لجميع خلايا الثدييات، إلا أن وظيفتها(وظائفها) العامة في غياب عقار السيكلوسبورين أ المثبط للمناعة غير معروفة. في المقابل، يبدو أن الخلايا المناعية المرتبطة بالوزن الجزيئي العالي hsp90 تلعب دورًا في الاتجار بالبروتين حيث ثبت أنها تربط مستقبلات الكورتيكويد السكري - hsp90 و p53 · hsp90 بالبروتين الحركي الداينين للحركة الرجعية على طول الأنابيب الدقيقة. ترتبط هذه الخلايا المناعية بالداينين السيتوبلازمي بشكل غير مباشر من خلال ارتباط مجال إيزوميراز الببتيديل بروليل المناعي (PPIase) بالديناميتين، وهو مكون من مركب داينكتين المرتبط بالداين (Galigniana، MD، Harrell، JM، O'Hagen، HM، Ljungman، M.، and Pratt، WB (2004) J. Biol. كيم. 279، 22483-22489). هنا، نظهر أن CyP - A موجود في معقدات غير متجانسة أصلية تحتوي على داينين سيتوبلازمي يمكن تشكيله في أنظمة خالية من الخلايا. نشاط مصاوغات البروليل غير مطلوب لتشكيل مركب الداينين، لكن جزء مجال PPIase من FKBP52 يمنع التكوين المعقد ويرتبط CyP - A بالديناميتين بطريقة تعتمد على مجال PPIase. يمكن تشكيل معقدات CyP - A غير المتجانسة التي تحتوي على التوبولين والداينين في سيتوسول محضر في ظل ظروف تثبيت الأنابيب الدقيقة، ويتركز CyP - A في الخلايا الليفية للفأر مع الأنابيب الدقيقة. يتم تعطيل التوطين باستخدام الأنابيب الدقيقة بسبب الإفراط في التعبير عن جزء مجال PPIase. وبالتالي، فإننا نستنتج أن CyP - A يرتبط في المختبر وفي الجسم الحي بمركب البروتين الحركي للداينين/دايناكتين ونقترح أن CyP - A قد يؤدي وظيفة عامة تتعلق بربط البضائع للحركة الرجعية على طول الأنابيب الدقيقة. The cyclophilins (CyPs) 1 الاختصارات المستخدمة هي: CyP, cyclophilin; CyP - A, cyclophilin - A; PPIase, peptidylprolyl isomerase; FKBP, FK506 - binding protein; hsp, heat shock protein; CsA, cyclosporin A; CyP -40, cyclophilin 40; TPR, tetratricopeptide repeat; GR, glucorticoid receptor; GST, glutathione S - transferase; GSH, glutathione; DIC, dynein intermediate chain; TES, 2 - {[2 - hydroxy -1,1 - bis (hydroxymethyl) ethino} ethanesulfonic acid; Meses, 4 - morpholineethanesulfonic acid; HISS, high ionic strength; HIV, human immunodeficiency .1 الاختصارات المستخدمة هي: Cyphil, CyP - Acylphilinil; PP - I - Ibityl, peptilaselybilase; FKBis, FK6 - binding protein; Cycl, Cycl, CYP -40; Cyclorporin, Tepheptic; GL, GL - tepheptoriferione, GL; GL, gluticortic, DH; DH; DH, gluticoriferion, DH; {2, 2, 2,}. 1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1315-1347 Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar and 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409 Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). تربط السيكلوفيلينات عقار السيكلوسبورين أ (CsA)، وتربط فئة ثانية من الخلايا المناعية، البروتينات الرابطة FK506 (FKBPs)، العقاقير المثبطة للمناعة FK506 والراباميسين. تمتلك الخلايا المناعية نشاط إيزوميراز الببتيديل بروليل (PPIase)، وتحتل الأدوية المثبطة للمناعة موقع PPIase على الخلايا المناعية، مما يمنع قدرتها على توجيه الأيزومير من روابط الببتيديل بروليل في المختبر. تم عزل CyP - A كبروتين ارتباط تقارب عالي 17 كيلو دالتون للسيكلوسبورين A (3Handschumacher R.E. Harding M.W. Rice J. Drugge R.J. Speicher D.W. Science. 1984 ؛ 226: 544-547 Crossref PubMed Scopus (1452) الباحث العلمي من Google)، وتبين لاحقًا أنه نفس بروتين 17 كيلو دالتون (4 Fischer G. Wittmann - Liebold B. Lang K. Kiefhaber T. Schmid F.X. Nature. 1989 ؛ 337: 476-478 Crossref PubMed Scopus (1209) Google Scholar، 5Takahashi N. Hayano T. Suzuki M. Nature. 1989 ؛ 337: 473-475 Crossref PubMed Scopus (939) الباحث العلمي من Google) الذي كان معروفًا بنشاط PPIase وتسريع إعادة طي البروتين منزوع اليوريا في المختبر (6 Fischer G. Bang H. Biochim. Biophys. Acta. 1985; 828: 39-42 Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar). تبين لاحقًا أن CyP - A يوجه التأثير المثبط للمناعة لـ CsA (7Liu J. Immunol. اليوم. 1993 ؛ 14: 290-295 تم عرض ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar)، و FKBP الصغير، FKBP12، ليكون هدفًا للتأثيرات المثبطة للمناعة لـ FK506 و rapamycin (8Bierer B.E. Mattila P.S. Standaert r.f. Herzenberg L.A. Burakoff S.J. Crabtree G. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990 ؛ 87: 9231-9235 Crossref PubMed Scopus (632) Google Scholar). في كل من حالة CyP - A المرتبط بـ CsA وحالة FK506 - bound FKBP12، فإن الهدف النهائي لمركب الدواء المناعي هو بروتين فوسفاتاز الكالسينيورين (للمراجعة انظر المرجع. 9 Ivery M.T. Med. Res. Rev. 2000; 20: 452-484 Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). الهدف النهائي لـ FKBP12 المرتبط بالراباميسين هو كيناز مرتبط بالفوسفوانوزيتيد 3 كيناز يسمى FRAP (البروتين المرتبط بالراباميسين FKBP) (10Brown E.J. Albers M.W. Shin T.B. Ichikawa K. Keith CT Lane W.S. Schreiber S.L. Nature. 1994 ؛ 369: 756-758 Crossref PubMed Scopus (1661) الباحث العلمي من Google)، RAFT1 (rapamycin and FKBP12 target 1) (11Sabatini D.M. Erdjument - Promage H. Lui M. Tempst P. Snyder S.H. Cell. 1994 ؛ 78: 35-43 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (1221) الباحث العلمي من Google)، أو mTOR (هدف الثدييات للراباميسين) (12Schmelzle T. Hall M.N. Cell. 2000 ؛ 103: 253-262 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (1724) الباحث العلمي من Google). لا ترتبط الأدوية المثبطة للمناعة ولا الخلايا المناعية CyP - A و FKBP12 وحدها بأهداف البروتين الثانية لكبت المناعة. ترتبط المجمعات المناعية الدوائية فقط بالكالسينورين أو FRAP/RAFT1/mTOR. على الرغم من أن معظم العمل على الخلايا المناعية قد ركز على CyPs الصغيرة و FKBPs، مثل CyP - A و FKBP12، فقد تم تحديد الخلايا المناعية عالية الوزن الجزيئي التي تحتوي على مجالات لتفاعلات البروتين الإضافية أو النشاط الأنزيمي بالإضافة إلى مجال PPIase الذي يربط الأدوية المثبطة للمناعة (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409 Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). تم اكتشاف العديد من هذه الخلايا المناعية عالية الوزن الجزيئي كمكونات لمستقبلات الستيرويد - hsp90 غير المتجانسة. وهي تشمل CyP -40 و FKBP51 و FKBP52 (تمت مراجعتها في المرجع. 13 برات دبليو بي توفت دي أو إكسب. Biol. Med. 2003; 228: 111-133 Crossref PubMed Scopus (1260) Google Scholar)، ولا يشاركون في الإجراءات المثبطة للمناعة لـ CsA أو FK506. تمتلك هذه الخلايا المناعية نطاقات تكرار رباعي الببتيد (TPR) التي ترتبط بموقع مستقبل TPR الموجود في الطرف C من البروتين المرافق الوفير والواسع الانتشار hsp90. تم اقتراح دورين لهذه الخلايا المناعية المرتبطة بـ hsp90 في عمل مستقبلات الستيرويد. Riggs et al. (14 Riggs D.L. Roberts P.J. Chirillo S.C. Cheung - Flynn J. Prapapanich V. Ratajczak T. Gaber R. Picard D. Smith D.F. EMBO J. 2003; 22: 1158-1167 أظهر Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar) أن FKBP52 يعمل بشكل انتقائي على تنشيط جين المراسل المعتمد على مستقبلات القشرية السكرية (GR) عن طريق زيادة التقارب المرتبط بالهرمونات للمستقبلات. يتطلب هذا التأثير نشاط مصاوغ البروليل لـ FKBP52 ويتم حظره بواسطة FK506. ركز خط آخر من الأبحاث على دور الخلايا المناعية الملزمة لـ hsp90 في استهداف حركة GR إلى النواة (تمت مراجعتها في المرجع. 15Pratt WB Galigniana MD Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. إشارة. 2004 ؛ 16: 857-872 Crossref PubMed Scopus (238) الباحث العلمي من Google). لا يتأثر عمل هذه الخلايا المناعية في حركة المستقبلات بوجود الأدوية المثبطة للمناعة، وبالتالي لا يتطلب نشاط إيزوميراز البروليل. بالإضافة إلى الخلايا المناعية لمجال TPR، تحتوي المضاعفات المناعية غير المتجانسة GR· hsp90 الممتصة من المحللات الخلوية على داينين سيتوبلازمي (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt WB. J. Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 17Davies T.H. Ning Y.M. Sanchez E.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 4597-4600 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar)، وهو محرك جزيئي يعالج على طول مسارات الأنابيب الدقيقة نحو النواة (18Vallee R.B. Gee M.A. Trends Cell Biol. 1998 ؛ 8: 490-494 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (52) الباحث العلمي من Google). في هذه المجمعات، يعمل مجال PPIase للمناعة كمجال مرتبط بالبروتين لربط وحدة GR· hsp90 بمحرك البروتين (19Silverstein AM Galigniana Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir JM Pratt WBJ Biol. Chem. 1999; 274: 36980-36986Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt WB Galigniana M.D. Biochemistry. 2002; 41: 5581-5587 Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002 ؛ 41: 13602-13610 Crossref PubMed Scopus (90) الباحث العلمي من Google). إن ارتباط الخلايا المناعية بالداينين السيتوبلازمي غير مباشر عن طريق مكون الديناميتين في مركب الداينكتين المرتبط بالداينين (22Galigniana M.D. Harrell JM O'Hagen HM Ljungman M. Pratt WBJ Biol. كيم. 2004 ؛ 279: 22483-22489 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (128) الباحث العلمي من Google). يتنافس ربط CyP -40 أو FKBP52 بالداينين بواسطة جزء مجال PPIase النقي من FKBP52 (21Galigniana MD Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt WB Biochemistry. 2002 ؛ 41: 13602-13610 Crossref PubMed Scopus (90) الباحث العلمي من Google)، وقد ثبت أن FKBP52 المنقى يرتبط مباشرة عبر مجال PPIase الخاص به بالديناميتين المنقى مناعياً (22Galigniana M.D. Harrell J.M. O'Hagen HM Ljungman M. Pratt WBJ Biol. كيم. 2004 ؛ 279: 22483-22489 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (128) الباحث العلمي من Google). هناك درجة عالية من التشابه في بنية مجال PPIase بين مختلف السيكلوفيلين (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409 Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). يشترك مجال PPIase لـ CyP -40 البقري، على سبيل المثال، في هوية 61 ٪ مع تسلسل CyP - A البشري، وباستثناء واحد، تكون بقايا الموقع النشطة متطابقة (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409 Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). وبالتالي، تساءلنا عما إذا كان CyP - A، مثل متجانسه عالي الوزن الجزيئي hsp90 - binding CyP -40، يرتبط من خلال مجال PPIase بمركب الداينين/الداينكتين. هنا نظهر أن الامتصاص المناعي لـ CyP - A من حالّة الخلايا الشبكية أو الخلية L ينتج امتصاص مناعي للداينين السيتوبلازمي. الارتباط بالداينين غير مباشر عبر مكون الديناميتين في مركب الداينكتين المرتبط بالداينين، ويرتبط CyP - A بالديناميتين بطريقة ينافسها جزء مجال PPIase المنقى من FKBP52. الترسيب المناعي لـ CyP - A من السيتوسول المحتوي على باكليتاكسيل و GTP لتثبيت الأنابيب الدقيقة ينتج الترسيب المشترك من التوبولين والداينين بطريقة تعتمد على مجال إنزيم PPIase، ويتجمع Cyp - A مع الأنابيب الدقيقة في خلايا NIH 3T3. يجب أن تكون ملاحظة أن CyP - A مرتبط بمركب البروتين الحركي dynein/dynactin القائم على الأنابيب الدقيقة مفيدة في نهاية المطاف في تحديد وظيفة(وظائف) التدبير المنزلي لهذا المجال المناعي الوحيد في خلايا الثدييات في غياب الأدوية المثبطة للمناعة. المواد - كان تحليل الخلايا الشبكية للأرنب من الهكتارات الخضراء (أوريغون، ويسكونسن). تم شراء خليط مثبط الأنزيم البروتيني المصغر الكامل من Roche Diagnostics (مانهايم، ألمانيا). كان وسيط نقل العدوى Opti - MEM I من Invitrogen. كان كاشف الانتقال السريع للعدوى من بروميغا (ماديسون، ويسكونسن). كانت كواشف اللمعان الكيميائي المعززة من Amersham Biosciences. تم شراء الجلوتاثيون أغاروز، والبروتين A - سيفاروس، والجيلدانامايسين، وهيرودين، و CsA، والباكليتاكسيل، والفئران أحادية النسيلة IgG ضد α - tubulin، والفأر أحادي النسيلة IgG ضد GST، والأجسام المضادة للفئران والأرانب المضادة للفئران من سيجما. كان IgG متعدد النسائل للأرانب A -14 ضد c - myc oligopeptide من سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز، كاليفورنيا). كانت الأجسام المضادة الفلورية من المواد الكيميائية المناعية (ويست جروف، بنسلفانيا). كانت خلايا الإشريكية القولونية المترافقة مع بيروكسيداز الفجل المضاد للأرنب من نوع IgG وخلايا الإشريكية القولونية المتوافقة مع BL21 من بيرس. تم تحضير مصل الأرانب متعدد النسائل ضد CyP - A في مختبر سكريبس عن طريق التحصين ببروتين CyP - A البشري المؤتلف (23Saphire A.C. Bobardt M.D. Gallay P.A. EMBO J. 1999; 18: 6771-6785 Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar). تم شراء IgG أحادي النسيلة للفأر مقابل السلسلة الوسيطة 74 - kDa من داينين السيتوبلازمي للثدييات من Chemicon (Temecula، CA). تم وصف البلازميد pGEX1λT الذي يشفر متجه التعبير GST - rabbit FKBP52 Gly32 - Lys138 الذي يشتمل على المجال الأساسي PPIase I (المقدم من الأطباء ميشيل رينوار وكريستين راداني، UMR8612 CNRS، باريس، فرنسا) وتنقية البروتين الأساسي PPIase المجال I سابقًا (16Galigniana MD Radanyi C. Renoir J.M. Housley PRATT WBJ Biol. كيم. 2001 ؛ 276: 14884-14889 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (193) الباحث العلمي من Google). تم توفير بلازميد pECFP - N1 للتعبير عن بروتين السيانين الفلوري من قبل الدكتور راينر بيندورف (كلية الطب بجامعة ميشيغان، آن أربور، ميشيغان). الفيروس اللدود لمجال TPR الموسوم بـ FLAG لفوسفاتاز بروتين الفئران 5 (24Chen M.S. Silverstein AM Pratt WB Chinkers MJ Biol. Chem. 1996; 271: 32315-32320 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar) تم توفيره من قبل الدكتور مايكل شينكرز (جامعة جنوب ألاباما، موبايل، ألاباما). يتكون ترميز pCMVH50m المميز بعلامة myc من p50/dynamitin (25Burkhardt J.K. Echeverri C.J. Nilsson T. Vallee RBJ Cell Biol. 1997 ؛ 139: 469-484 Crossref PubMed Scopus (556) Google Scholar) كانت هدية لطيفة من الدكتور ريتشارد فالي (كلية الطب بجامعة ماساتشوستس، وورسيستر، ماساتشوستس). كان البلازميد pGEX -2T الذي يشفر GST - CyP - A هدية لطيفة من الدكتور جيريمي لوبان (جامعة كولومبيا) (26Luban J. Bossolt KL Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993 ؛ 73: 1067-1078 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (703) الباحث العلمي من Google). تم استكمال جميع مخازن الحضانة المستخدمة في هذه الدراسات بمثبطات الأنزيم البروتيني (قرص واحد من كومبليت ميني بلس 1000 وحدة من الهيرودين/2 مل من المخزن المؤقت). تم امتصاص الامتصاص المناعي لـ CyP - A الداخلي و Dynein -50 ميكرولتر من محللات الخلايا الشبكية إلى 16 ميكرولتر من البروتين A - Sepharose مع إما 5 ميكرولتر من مصل الأرانب المضاد ضد CyP - A أو 5 ميكرولتر من IgG الفأر ضد سلسلة dynein الوسيطة. بعد ساعتين عند 4 درجات مئوية، تم غسل الكريات باستخدام عازل TEGM (10 مم TES عند الرقم الهيدروجيني 7.6، 50 مم NaCl، 4 مم EDTA، 10 ٪ v/v الجلسرين، و 20 مم Na2MoO4). تم حل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام SDS - polyacrylamide، ونقلها كهربائيًا إلى غشاء Immobilon P، وتم نقشها غربيًا. تشكيل المجمعات مع GSH - Agarose - Immobilized GST - CyP A -80 ميكرولتر من GSH - agarose في 80 ميكرولتر من TEG buffer (TEGM buffer without molybdate) تم تحضينها عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين مع 10 ميكرولتر من cytosol من BL21 E. coli overexpress إما GST البشري أو GST - CyP - A البشري. تم غسل الكريات وإعادة تحضينها لمدة ساعتين إضافيتين في TEG buffer مكملة بـ 0.5 متر من كلوريد الصوديوم و 0.05 ٪ من Nonidet P -40 وغسلها ثلاث مرات مع TEG buffer ومرتين مع 10 مم Hepes عند درجة الحموضة 7.5. تم تحضين الكريات المغسولة التي تحتوي على GST - CyP - A المثبت (أو GST وحده) لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع 50 ميكرولتر من محللات الخلايا الشبكية المكملة بمثبطات الأنزيم البروتيني، و 5 ميكرولتر من نظام تجديد ATP (50 مم ATP، 250 مم فوسفات الكرياتين، 20 مم أسيتات المغنيسيوم، و 100 وحدة/مل من فوسفوكيناز الكرياتين)، والببتيدات المشار إليها في المخزن المؤقت HKD (10 مم Hepes عند الرقم الهيدروجيني 7.5، 100 مم KCl، و 2 مم dithiothreitol). تم زراعة ربط الخلايا الليفية من CyP - A إلى Dynamitin - L929 في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع استكمال 10 ٪ من مصل العجل البقري والمضادات الحيوية. عندما كانت الخلايا متلاصقة بنسبة 50 ٪، تم استبدال الوسيط بوسيط نقل العدوى Opti - MEM I واستمرت الحضانة لمدة ساعة واحدة. تم شفط الوسط واستبداله بخليط نقل العدوى (بنسبة 3 ميكرولتر من الجسيم الشحمي/ميكروغرام من الحمض النووي) تم تحضينه مسبقًا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في Opti - MEM I، والذي يحتوي على 3 ميكروغرام من ترميز البلازميد pCMVH50m الموسوم بالفطريات لـ p50/الديناميتين. بعد 1.5 ساعة من انتقال العدوى، تم استبدال الخليط بوسيط منتظم. بعد 36 ساعة، تم حصاد الخلايا وتمزيقها عن طريق تجانس Dounce في عازل HE (10 مم Hepes عند الرقم الهيدروجيني 7.5، 1 مم EDTA، ومثبطات الأنزيم البروتيني) وطردها مركزيًا عند 100000 × جم لمدة 30 دقيقة. تم تدوير السيتوسول الخلوي (250 ميكرولتر) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية مع 16 ميكرولتر من البروتين A - سيفاروس و 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة للفطريات. تم شفط المادة الطافية، وتم تجريد الحبيبة من البروتينات الممتصة بالمناعة عن طريق الحضانة المسبقة مع محلول عازل مكمل بـ 0.5 متر كلوريد الصوديوم و 0.05 ٪ نونيديت P -40. بعد ساعتين، تم غسل العينات ثلاث مرات باستخدام عازل TEG ومرتين باستخدام عازل HE. تم تحضين الكريات على الجليد مع 10 ميكرولتر من المحللات البكتيرية المفرطة في التعبير عن GST - CyP - A في وجود أو عدم وجود 90 ميكروغرام من مجال PPIase المنقى من FKBP52. تم تعديل الحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر مع عازلة HKD. بعد ساعة واحدة، تم غسل الكريات بالعازل TEGM وتم حل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي متبوعًا بالنشف الغربي. تم تحضين الخلايا الليفية المثبتة بالأنابيب الدقيقة L929 لمدة 15 دقيقة باستخدام 20 ميكرومتر باكليتاكسيل قبل التمزق عن طريق تجانس Dounce في منطقة MES العازلة (0.1 م Mes، 1 مم EGTA، و 1 مم MgCl2، pH 6.9) مع 20 ميكرومتر باكليتاكسيل، 100 ميكرومتر GTP، ومثبطات الأنزيم البروتيني. قبل الامتزاز، تمت إضافة 0.05 ٪ Nonidet P -40 إلى المحلول الخلوي وتم تدويره لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ثم طرده مركزيًا عند 30 رطل في البوصة المربعة لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد جوي. تم تحضين السوائل (250 ميكرولتر) من السيتوسول عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع 25 ميكرولتر من المحللات من البكتيريا غير المعبرة و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت HKD أو 25 ميكرولتر من المحللات من البكتيريا المفرطة في التعبير عن GST - CyP - A و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت HKD أو 25 ميكرولتر من المحللات من البكتيريا المفرطة في التعبير عن GST - CyP - A و 325 ميكروغرام من مجال PPIase المنقى لـ FKBP52 في المخزن المؤقت HKD. كما احتوى العازل HKD على مثبطات الأنزيم البروتيني. ثم تم تجميد GST - CyP - A عن طريق الدوران باستخدام GSH - agarose لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. تم غسل الكريات بالعازل TEGM، وتم حل البروتينات عن طريق اللطخات المناعية تم حل كريات المناعة على هلام SDS -10 ٪ بولي أكريلاميد ونقلها إلى أغشية Immobilon P. تم فحص الأغشية باستخدام 0.1 ٪ MAB1618 لسلسلة داينين الوسيطة، و 0.1 ٪ A -14 لـ myc - dynamitin، و 0.05 ٪ من مصل الأرانب المضاد لـ CyP - A، و 0.05 ٪ من الفئران IgG لضريبة السلع والخدمات. نمت خلايا NIH 3T3 المناعية غير المباشرة على شرائح 11 × 22 مم مغطاة بالفيبرينوجين في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع استكمال 10 ٪ من مصل العجل البقري والمضادات الحيوية. تم شطف الشرائح بمحلول الفوسفات والملح وتثبيتها لمدة 4 ساعات في محلول فورمالديهايد p 4 ٪ محضر حديثًا في محلول عازلة للفوسفات والملح. تم تغلغل الخلايا عن طريق غمر الشرائح في الأسيتون عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد غسل الشرائح المغطاة بمنظم الفوسفات والملح، تم تحضينها مسبقًا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في محلول HISS (محلول عالي القوة الأيونية) (20 مم TRIS عند الرقم الهيدروجيني 8.0، 0.63 م كلوريد الصوديوم، 0.1 ٪ بين 20، و 3.5 ٪ ألبومين مصل الأبقار) مكمل بمصل حصان 1 ٪. تم غسل الخلايا في عازلة هيس وتم تثبيتها مناعيًا عن طريق قلب الشرائح على محلول 50 ميكرولتر من عازلة هيس يحتوي على 1 ميكرولتر من مصل الفئران المضاد لـ ألفا و 0.2 ميكرولتر من مصل الأرانب المضاد لـ CyP - A. بعد ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة، تم غسل الخلايا في مخزن HISS المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم تم تحضينها بتخفيف 1/100 للأجسام المضادة المقابلة (الحمار المقترن بالرودامين المضاد للأرانب IgG والحمار المقترن بالفلوريسين المضاد للفئران IgG). تم تركيب الشرائح على شرائح المجهر باستخدام قطرة من وسط تركيب مضاد للبهتان (المجسات الجزيئية، لايدن، هولندا)، ولوحظت الخلايا باستخدام مجهر أوليمبوس فلو فيو 500 متحد البؤرة. يتم استرداد CyP - A في المركب غير المتجانس الأصلي مع Dynein - لتحديد ما إذا كان CyP - A موجودًا في المضاعفات غير المتجانسة الأصلية مع dynein، تم امتصاص المحللة الشبكية بأجسام مضادة موجهة ضد Immunophilin أو ضد السلسلة الوسيطة من dynein وتم اكتشاف البروتينات المرتبطة بالكريات المناعية المغسولة عن طريق التلطيخ المناعي. كما هو موضح في الشكل 1 أ، أدى الامتصاص المناعي للداينين إلى الامتصاص المشترك لـ CyP - A (الحارة 3) والامتصاص المناعي لـ CyP - A أدى إلى الامتصاص المشترك للداينين (الحارة 5)، بما يتفق مع فكرة أن CyP - A موجود في المضاعفات غير المتجانسة الأصلية مع الداينين السيتوبلازمي. في الشكل 1، الممرات 6-9، تم مسح الممرات الكاملة لكل كرية مناعية مع كل جسم مضاد لإثبات خصوصية التفاعل. لإظهار أن المركب لا يتضمن كميات صغيرة فقط من أي من البروتينين، تم امتصاص كمية كبيرة من CyP - A مناعيًا من حالّة الخلايا الشبكية وتم تقييم الاستنفاد المناعي الناتج للداينين. كما هو موضح في الشكل 1 ب، زيادة الامتصاص المناعي لـ CyP - A كان مصحوبًا بزيادة الامتصاص المشترك للداينين (الممران 3 و 4). عند كمية أعلى من الأجسام المضادة، تم امتصاص معظم CyP - A وكمية كبيرة من الداينين من حالّة الخلايا الشبكية (راجع الحارة 7 مع الحارة 5). من خلال مسح الحارات باستخدام جهاز تصوير الفوسفور وطرح قيمة خلفية مجاورة، تم تحديد وحدات عشوائية لكل بروتين متبقي في غير المناعة (الحارة 5) وأعلى مادة طافية مناعية (الحارة 7). أدى استنفاد 75 ٪ من CyP - A إلى استنفاد 59 ٪ من الداينين، مما يشير إلى أن غالبية كل بروتين في مجمع غير متجانس يحتوي على البروتين الآخر. لإظهار أن الارتباط ليس تفاعلًا ضعيفًا وربما غير محدد، تم امتصاص محللة الخلايا الشبكية بمضاد CyP - A وتم غسل الكريات المناعية في ظل ظروف قاسية بشكل متزايد. كما هو موضح في الشكل 1C، استمر مركب CyP - A مع الداينين عند الغسيل باستخدام عازل TEG بالإضافة إلى 100 مم من كلوريد الصوديوم (راجع الحارتين 2 و 3) والغسيل باستخدام TEG بالإضافة إلى كلوريد الصوديوم و 0.1 ٪ Nonidet P -40 (الحارة 3). يؤدي الغسل في ظل ظروف منظفات قاسية للغاية (NaCl، Nonidet P -40، 0.5 ٪ deoxycholate، و 1 ٪ sodium dodecyl sulfate) إلى فصل الجسم المضاد CyP - A عن البروتين A - Sepharose pellet بحيث يتم فقدان معظم CyP - A والداينين. ومع ذلك، يمكن رؤية بعض مركبات CyP - A و dynein في ظل هذه الظروف القاسية للغاية للغسيل (الحارة 5). لقد استخدمنا سابقًا محللات الخلايا الشبكية لتحقيق التجميع الخالي من الخلايا لمجمعات GR· hsp90 التي تحتوي على مناعة ملزمة لـ hsp90 وداينين (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt WB. J. Biol. كيم. 2001 ؛ 276: 14884-14889 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (193) الباحث العلمي من Google). في تجربة الشكل 2، تم تثبيت GST - CyP - A على خرز الجلوتاثيون وتم تحضين الخرزات بتحلل الخلايا الشبكية تحت نفس ظروف التجميع غير المتجانسة GR. لم تحتوي خرزات الجلوتاثيون المرتبطة بضريبة السلع والخدمات وحدها على داينين بعد الحضانة مع تحليل الخلايا الشبكية (الحارة 2)، ولكن الخرزات المرتبطة بضريبة السلع والخدمات- CyP - A تحتوي على داينين (الحارة 5). CyP - A PPIase Domain is required for Complex with Dynein - The formation of heterocomplexes containing the hsp90 - binding immunophilins and dynein requires the PPIase domain of the immunophilin and can be blocked by competition with the PPIase domain fragment of FKBP52 (16Galigniana M.D. Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt WB. J Biol. Chem. 2001; 276: 14884-14889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar, 19Silverstein AM Galigniana M.D. Kanelakis K.C. Radanyi C. Renoir JM Pratt WBJ Biol. Chem. 1999; 274: 36980-36986Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (161) Google Scholar, 20Harrell J.M. Kurek I. Breiman A. Radanyi C. Renoir J.M. Pratt WB Galigniana M.D. Biochemistry. 2002; 41: 5581-5587 Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Galigniana M.D. Harrell J.M. Murphy P.J. Chinkers M. Radanyi C. Renoir J.M. Zhang M. Pratt W.B. Biochemistry. 2002 ؛ 41: 13602-13610 Crossref PubMed Scopus (90) الباحث العلمي من Google). في تجربة الشكل 3، تم تحضين الخرزات المرتبطة بضريبة السلع والخدمات- CyP - A مع المحللة الشبكية في وجود المحللة من البكتيريا التي تعبر عن جزء مجال PPIase FKBP52 ثم تم غسل الخرزات وفحصها للبروتينات المرتبطة. منع وجود جزء مجال PPIase ارتباط CyP - A بالداينين (راجع الحارتين 2 و 4)، في حين أن وجود جزء مجال TPR لم يؤثر على ربط الداينين (الحارة 5). لقد أظهرنا سابقًا أن جزء مجال TPR يمنع ارتباط الخلايا المناعية لمجال TPR بـ hsp90 ولكنه لا يؤثر على ارتباطها بالداينين (16Galigniana MD Radanyi C. Renoir J.M. Housley P.R. Pratt WBJ Biol. كيم. 2001 ؛ 276: 14884-14889 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (193) الباحث العلمي من Google). الأهم من ذلك، أن CsA لا يؤثر على تكوين مركب CyP - A مع داينين (الحارة 6)، مما يشير إلى أن نشاط مصاوغ البروليل غير مطلوب. تفاعل CyP - A مع الديناميتين - في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن FKBP52 المنقى يرتبط مباشرة بـ myc - dynamitin المنقى، وهو مكون 50 كيلو دالتون من مركب دايناكتين المرتبط بالداينين (22Galigniana M.D. Harrell JM O'Hagen HM Ljungman M. Pratt WBJ Biol. كيم. 2004 ؛ 279: 22483-22489 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (128) الباحث العلمي من Google). في الشكل 4، تم استخدام الجسم المضاد للفطريات للامتصاص المناعي للخلايا الخلوية من الخلايا المفرطة في التعبير عن الديناميتين الفطري وتم تحضين الكرية المناعية الممزوجة بالملح مع المحللات من البكتيريا التي تعبر عن GST - CyP - A. يرتبط GST - CyP - A بالديناميتين الفطري (الحالة 2)، وتم حظر الربط بواسطة جزء PPIase من FKBP52 (الحالة 3). وبالتالي، على غرار الخلايا المناعية المرتبطة بـ hsp90، يبدو أن CyP - A يرتبط بالداينين بشكل غير مباشر عن طريق الارتباط بالديناميتين. يوجد الأنبوب في المضاعفات غير المتجانسة CyP - A - لقد أظهرنا مؤخرًا أن المضاعفات المناعية غير المتجانسة GR يتم امتصاصها من سيتوسول الخلية L المحضر بمنطقة عازلة مثبتة للأنابيب الدقيقة تحتوي على توبيولين وكذلك داينين. 2J. M. Harrell, M. D. Galigniana, P. J. M. Murphy, Y. Morishima, and W. B. Pratt, manuscript in preparation. في تجربة الشكل 5، عولجت الخلايا L لفترة وجيزة باستخدام الباكليتاكسيل ثم تمزقت في محلول منظم يحتوي على كل من الباكليتاكسيل و GTP لتثبيت الأنابيب الدقيقة. تم تحضير السيتوسول أيضًا دون ظروف تثبيت الأنابيب الدقيقة. تمت إضافة المحللات من البكتيريا التي تعبر عن GST - CyP - A إلى كل تحضير للخلايا، وتم تحضين الخليط، وتم امتزاز GST - CyP - A إلى خرز الجلوتاثيون. كما هو موضح في الشكل 5، الحالة 2، يوجد الداينين في حبيبات GST - CyP - A المحضرة تحت أي من الحالتين ولكن لا يوجد التوبولين إلا عند امتزاز GST - CyP - A من سيتوسول المحضر في ظل ظروف تثبيت الأنابيب الدقيقة. إذا كان جزء مجال PPIase موجودًا للتنافس على ربط CyP - A بالديناميتين، فلا يوجد داينين ولا توبولين في كرية GST - CyP - A (الشرط 3). تدعم هذه النتيجة نموذجًا يرتبط فيه CyP - A بالأنابيب الدقيقة من خلال ارتباطه بمركب الداينين/الدايناكتين. يتم توطين CyP - A إلى الأنابيب الدقيقة في الشكل Vivo - In. 6، تم نقل الخلايا الليفية للفأر 3T3 مع تشفير البلازميدات لجزء مجال PPIase من FKBP52 وبروتين السيانين الفلوري. بعد 36 ساعة، تم تثبيت الخلايا وتثبيتها مناعيًا من أجل التوبولين (الشكل 6A، أخضر) و CyP - A (الشكل 6B، أحمر). في الخلايا غير المصابة، يُنظر إلى CyP - A على أنه يتغاطن مع التوبولين (انظر الدمج في الشكل. 6C). الصورة الزرقاء في الشكل. يظهر 6D خلية مصابة بالعدوى في منتصف الحقل. لم يؤثر التعبير عن جزء مجال PPIase على نمط اللييفات في الأنابيب الدقيقة (الشكل 6A)، لكنه عطل توزيع اللييفات لـ CyP - A (الشكل 6B). يتوافق هذا مع جزء مجال PPIase الذي يتنافس على توطين CyP - A إلى الأنابيب الدقيقة. هنا، أظهرنا أن المناعي أحادي المجال، CyP - A، يتصرف مثل المناعي لمجال TPR المرتبط بـ hsp90 في الارتباط بمركب البروتين الحركي للداينين السيتوبلازمي (الشكل 1). يتنافس جزء مجال PPIase من FKBP52 على ربط الداينين ؛ ومع ذلك، بقدر ما يحدث الارتباط في وجود أو غياب CsA (الشكل 3)، فإن نشاط الأيزوميراز لـ CyP - A غير مطلوب. وبالتالي، فإن ربط مجالات إنزيم PPIase المناعي بمركب البروتين الحركي يختلف اختلافًا كبيرًا عن ربط CyP - A أو FKBP12 بالكالسينيورين حيث يكون فقط المناعي المرتبط بـ CsA - أو FK506 هو شريك ربط الكالسينيورين. مرة أخرى، مثل الخلايا المناعية المرتبطة بـ hsp90، يبدو أن CyP - A يرتبط بالداينين بشكل غير مباشر من خلال تفاعل مجال PPIase الخاص به مع مكون الديناميتين في مركب دايناكتين المرتبط بالداينين (الشكل 4). تعمل محركات داينين السيتوبلازمية على طول مسارات الأنابيب الدقيقة، ونظهر أن المضاعفات غير المتجانسة CyP - A التي تحتوي على التوبولين والداينين يمكن أن تتشكل في سيتوسول في ظل ظروف تثبيت الأنابيب الدقيقة (الشكل 5). الأهم من ذلك، نظهر أن CyP - A يتجمع مع الأنابيب الدقيقة في الخلايا الليفية للفأر 3T3 وأن الارتباط بالأنابيب الدقيقة في الجسم الحي يتعطل بسبب التعبير المفرط عن جزء مجال PPIase من FKBP52 (الشكل 6). تدعم الملاحظات في المختبر وفي الجسم الحي معًا نموذجًا يرتبط فيه CyP - A بنظام الحركة الرجعية كمركب CyP - A - dynamitin - dynein - microtubule. يوجد CyP - A كبروتين وفير نسبيًا في سيتوبلازم جميع خلايا الثدييات (2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409 Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). وبالتالي، يجب أن يؤدي بعض وظائف التدبير المنزلي العامة المهمة للتوازن الخلوي. حتى الآن، ركزت دراسات CyP - A إلى حد كبير على هيكلها وعملها المثبط للمناعة من خلال ربط مركب CyP - A ·CsA بالكالسينورين (1Galat A. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1315-1347 Crossref PubMed Scopus (303) Google Scholar, 2Dornan J. Taylor P. Walkinshaw M.D. Curr. Top. Med. Chem. 2003; 3: 1392-1409 Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). أشارت التقارير العرضية إلى ارتباط CyP - A ببروتينات محددة، مثل مثبط YY1 لنسخ الجينات (27Yang WM Inouye C.J. Seto EJ Biol. Chem. 1995; 270: 15187-15193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar) وفيروس نقص المناعة البشرية، النوع 1 Pr55gag سلائف البولي بروتين (26Luban J. Bossolt KL Franke E.K. Kalpana G.V. Goff S.P. Cell. 1993; 73: 1067-1078 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (703) Google Scholar, 28Yoo S. Myszka D.G. Yeh C.Y. McMurray M. Hill C.P. Sundquist W.I.J. Mol. بيول. 1997 ؛ 269: 780-795 Crossref PubMed Scopus (226) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، فإن الارتباطات المبلغ عنها لم تؤد إلى نموذج عام لوظيفة CyP - A في خلايا الثدييات في غياب CsA. يمكن أن يكشف ارتباط CyP - A بمركب البروتين الحركي dynein/dynactin عن وظيفة عامة للتدبير المنزلي. يُعتقد أن داينين يرتبط ببضائعه بشكل غير مباشر من خلال دايناكتين، ولكن من غير المعروف كيف يتم التعرف على البضائع (29 هيروكاوا ن. ساينس. 1998 ؛ 279: 519-526 Crossref PubMed Scopus (1369) الباحث العلمي من Google). لقد لخصنا في المقدمة كيف تستهدف الخلايا المناعية لمجال TPR اثنين من البروتينات الخاضعة للتنظيم hsp90، GR و p53، إلى مجمع داينين/داينكتين لحركتها الرجعية إلى النواة (15Pratt WB Galigniana M.D. Harrell J.M. DeFranco D.B. Cell. إشارة. 2004 ؛ 16: 857-872 Crossref PubMed Scopus (238) الباحث العلمي من Google). يمكن أن يشارك CyP - A في التعرف على البضائع إما بشكل مباشر أو غير مباشر كجزء من مجمع البروتين. ومن المثير للاهتمام أن هناك العديد من الأدلة التي تشير إلى أن فيروس نقص المناعة البشرية يستخدم الداينين وشبكة الأنابيب الدقيقة لنقل جينومه إلى النواة. لأن فيروس نقص المناعة البشرية يتطلب CyP - A للتكاثر بكفاءة في الخلايا البشرية (30Franke E.K. Yuan H.E. Luban J. Nature. 1994 ؛ 372: 359-362 Crossref PubMed Scopus (645) Google Scholar، 31Thali M. Bukovsky A. Kondo E. Rosenwirth B. Walsh CT Sodroski J. Gottlinger HG Nature. 1994 ؛ 372: 363-365 Crossref PubMed Scopus (559) الباحث العلمي من Google)، يمكن للمرء أن يتصور أن CyP - A يعمل كموصل بين فيروس نقص المناعة البشرية وشبكة الأنابيب الدقيقة من أجل تسهيل نقل آمن للجينوم الفيروسي إلى النواة. نشكر راينر بنندورف ومايكل شينكرز وجيريمي لوبان وكريستين راداني وميشيل رينوار وريتشارد فالي على توفير الكواشف المستخدمة في هذا العمل.