Les ribonucléases de mammifères interagissent très fortement avec l'inhibiteur intracellulaire de la ribonucléase (IR). Les cellules eucaryotes exposées aux ribonucléases de mammifères sont protégées de leur action cytotoxique par l'inhibition intracellulaire des ribonucléases par RI. La ribonucléase pancréatique humaine (HPR) est structurellement et fonctionnellement très similaire à la RNase A bovine et interagit avec la RI humaine avec une forte affinité. Dans la présente étude, nous avons étudié l'implication de Lys-7, Gln-11, Asn-71, Asn-88, Gly-89, Ser-90 et Glu-111 dans la HPR dans son interaction avec l'inhibiteur de la ribonucléase humaine. Ces résidus de contact ont été mutés soit individuellement soit en combinaison pour générer les mutants K7A, Q11A, N71A, E111A, N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A et K7A/Q11A/N71A/E111A. Parmi ceux-ci, huit mutants, K7A, Q11A, N71A, S90R, E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A et K7A/N71A/E111A, ont montré une capacité à échapper à l'IR plus que l'HPR de type sauvage, le triple mutant K7A/N71A/E111A ayant la résistance maximale à l'IR. En conséquence, ces variants présentaient une activité cytotoxique plus élevée que les HPR de type sauvage. La mutation de Gly-89 dans HPR n'a produit aucun changement dans la sensibilité de HPR pour RI, alors qu'il a été rapporté que la mutation du résidu équivalent Gly-88 dans RNase A a donné un variant avec une résistance accrue à RI et une cytotoxicité. Par conséquent, malgré son homologie considérable avec la RNase A, la HPR montre des différences dans son interaction avec la RI. Nous démontrons que l'interaction entre la ribonucléase pancréatique humaine et l'IR peut être perturbée par la mutation des résidus impliqués dans la liaison HPR-RI. Les mutants HPR cytotoxiques résistants aux inhibiteurs devraient être utiles dans le développement de molécules thérapeutiques. Les ribonucléases de mammifères interagissent très fortement avec l'inhibiteur intracellulaire de la ribonucléase (IR). Les cellules eucaryotes exposées aux ribonucléases de mammifères sont protégées de leur action cytotoxique par l'inhibition intracellulaire des ribonucléases par RI. La ribonucléase pancréatique humaine (HPR) est structurellement et fonctionnellement très similaire à la RNase A bovine et interagit avec la RI humaine avec une forte affinité. Dans la présente étude, nous avons étudié l'implication de Lys-7, Gln-11, Asn-71, Asn-88, Gly-89, Ser-90 et Glu-111 dans la HPR dans son interaction avec l'inhibiteur de la ribonucléase humaine. Ces résidus de contact ont été mutés soit individuellement soit en combinaison pour générer les mutants K7A, Q11A, N71A, E111A, N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A et K7A/Q11A/N71A/E111A. Parmi ceux-ci, huit mutants, K7A, Q11A, N71A, S90R, E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A et K7A/N71A/E111A, ont montré une capacité à échapper à l'IR plus que l'HPR de type sauvage, le triple mutant K7A/N71A/E111A ayant la résistance maximale à l'IR. En conséquence, ces variants présentaient une activité cytotoxique plus élevée que les HPR de type sauvage. La mutation de Gly-89 dans HPR n'a produit aucun changement dans la sensibilité de HPR pour RI, alors qu'il a été rapporté que la mutation du résidu équivalent Gly-88 dans RNase A a donné un variant avec une résistance accrue à RI et une cytotoxicité. Par conséquent, malgré son homologie considérable avec la RNase A, la HPR montre des différences dans son interaction avec la RI. Nous démontrons que l'interaction entre la ribonucléase pancréatique humaine et l'IR peut être perturbée par la mutation des résidus impliqués dans la liaison HPR-RI. Les mutants HPR cytotoxiques résistants aux inhibiteurs devraient être utiles dans le développement de molécules thérapeutiques. Inhibiteur de ribonucléase pancréatique humaine de ribonucléase séminale bovine Inhibiteur de ribonucléase humaine Les ribonucléases mammaliennes constituent une superfamille omniprésente de protéines avec un niveau élevé de divergence structurelle et fonctionnelle. Ceux-ci comprennent un groupe de protéines homologues isolées de nombreuses sources mammifères, aviaires, reptiliennes et amphibiennes et sont collectivement connues pour faire partie de la superfamille des RNases A (1Beintema J.J. Breukelman H.J. Carsana A. Furia A. D'Alessio G. Riordan J.F. Ribonucléases : Structures and Functions. Academic Press, New York1997: 245-269Crossref Google Scholar). La recrudescence actuelle de l'intérêt pour les RNases est le résultat de la découverte de RISBASES (RNases with Special Biological Actions), qui ont été identifiés comme influençant la croissance des cellules tumorales, le développement neurologique et la différenciation biologique (2D'Alessio G. Trends Cell Biol. 1993 ; 3: 106-109Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). Une fonction biologique importante des RNases mammifères peut être la défense de l'hôte, comme cela a été observé dans le cas des deux RNases éosinophiles, la protéine cationique éosinophile et la neurotoxine dérivée d'éosinophiles, qui présentent des activités antivirales, antibactériennes, antiparasitaires et neurotoxiques (3Domachowske J.B. Rosenberg H.F. J. Leukocyte Biol. 1997 ; 62: 363-368Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar, 4Lehrer R.I. Szklarek D. Barton A. Ganz T. Hamann K.J. Gleich G.J. Immunol. 1989 ; 142: 4428-4434PubMed Google Scholar, 5Rosenberg H.F. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 7876-7881Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar, 6Durack D.T. Ackerman S.J. Loegering D.A. Gleich G.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981 ; 78: 5165-5169Crossref PubMed Scopus (185) Google Scholar, 7Newton D.L. Walbridge S. Mikulski S.M. Ardelt W. Shogen K. Ackerman S.J. Rybak S.M. Youle R.J. J. Neurosci. 1994 ; 14: 538-544Crossref PubMed Google Scholar). Aussi, la Frog RNase onconase et la ribonucléase séminale bovine (BS-RNase)1 présentent une activité antitumorale (8Nitta K. Ozaki K. Ishikawa M. Furusawa S. Hosono M. Kawauchi H. Sasaki K. Takayanagi Y. Tsuiki S. Hakomori S. Cancer Res. 1994 ; 54: 920-927PubMed Google Scholar, 9Mikulski S.M. Grossman A.M. Carter P.W. Shogen K. Costanzi J.J. Int. J. Oncol. 1993 ; 3: 57-64PubMed Google Scholar, 10Vescia S. Tramontano D. Augusti-Tocco G. D'Alessio G. Cancer Res. 1980 ; 40: 3740-3744PubMed Google Scholar, 11Laccetti P. Portella G. Mastronicola M.R. Russo A. Piccoli R. D'Alessio G. Vecchio G. Cancer Res. 1992 ; 52: 4582-4586PubMed Google Scholar). La ribonucléase pancréatique humaine (HPR) est de nature sécrétoire et a été considérée comme une contrepartie de la RNase A pancréatique bovine (12Beintema J.J. Wietzes P. Weickmann J. Glitz J.J. Anal. Biochem. 1984 ; 136: 48-64Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 13Seno M. Futami J. Kosaka M. Seno S. Yamada H. Biochim. Biophys. Acta. 1994 ; 1218: 466-468Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar). Bien que la HPR partage 70% d'homologie avec la RNase A et possède des résidus structuraux et catalytiques clés similaires, elle présente certaines caractéristiques uniques (14Weickmann J.L. Elson M. Glitz D.G. Biochemistry. 1981 ; 20: 1272-1278Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar). HPR possède une activité substantielle contre l'ARN double brin, contient une proportion plus élevée de résidus basiques, son activité est influencée de manière différentielle par la force ionique et les ions divalents, et par rapport à la RNase A, elle a une extension carboxyle-terminale de quatre résidus, EDST (15Bardon ' A. Sierakowska H. Shugar D. Biochim. Biophys. Acta. 1976 ; 438: 461-473Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 16Sorrentino S. Libonati M. Arch. Biochem. Biophys. 1994 ; 312: 340-348Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar, 17Sorrentino S. Glitz D.G. Hamann K.J. Loegering D.A. Checkel J.L. Gleich G.J. J. Biol. Chem. 1992 ; 267: 14859-14865Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Nous avons rapporté plus tôt que la suppression de l'extension EDST carboxyle-terminale améliore l'activité RNase et la thermostabilité de l'HPR (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Bien que la RNase A et la HPR catalysent efficacement la dégradation de l'ARN, elles n'ont été associées à aucune action biologique spéciale et, par conséquent, leur rôle physiologique, en particulier celui de la HPR, n'est pas clairement défini. Les RNases ont beaucoup de potentiel en tant que chimiothérapie. L'onconase fait actuellement l'objet d'essais cliniques de phase III chez l'homme pour le traitement de la mésothélémie maligne (19 Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K.J. Biol. Chem. 1991 ; 266: 245-251Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) et a également été montré pour inhiber la réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type I dans les cellules humaines chroniquement infectées (20Saxena S.K. Gravell M. Wu Y.-N. Mikulski S.M. Shogen K. Ardelt W. Youle R.J. J. Biol. Chem. 1996 ; 271: 20783-20788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (79) Google Scholar). La majorité des RNases pancréatiques, à l'exception de la BS-RNase et de l'onconase, ne sont pas cytotoxiques. La principale raison apparente de cette faible cytotoxicité est la neutralisation de l'activité ribonucléolytique des RNases par l'inhibiteur cytosolique de la RNase (IR). Par conséquent, l'affinité d'une RNase pour l'IR intracellulaire pourrait jouer un rôle important dans la définition de son pouvoir cytotoxique. La HPR est extrêmement prometteuse en tant qu'agent thérapeutique pour les humains, et par rapport à d'autres RNases, elle est susceptible d'être moins immunogène et donc plus efficace. Lorsque les RNases « non cytotoxiques » sensibles à l'IR sont injectées directement dans les xénopusoocytes, qui manquent d'inhibiteurs puissants des RNases mammifères, elles présentent une activité cytotoxique comparable à la ricine et à la toxine diphtérique (21Saxena S.K. Rybak S.M. Winkler G. Meade H.M. McGray P. Youle R.J. Ackerman E.J. J. Biol. Chem. 1991 ; 266: 21208-21214Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). De plus, les deux classes de RNases ayant une activité anticancéreuse, l'onconase et la BS-RNase, se sont révélées résistantes à la protéine RI cytosolique, et leurs activités cytotoxiques semblent être une conséquence de leur capacité à échapper à l'inactivation par RI. (22Wu Y.N. Mikulski S.M. Ardelt W. Rybak S.M. Youle R.J. J. Biol. Chem. 1993 ; 268: 10686-10693Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992 ; 281: 343-348Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). La BS-RNase est un homodimère naturel qui est stabilisé par deux ponts disulfure inter-sous-unités. Le monomère BS-RNase est hautement homologue à la RNase A ; cependant, la forme dimère a une affinité beaucoup plus faible pour RI que le monomère libre (23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992 ; 281: 343-348Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). L'onconase échappe à RI en tant que monomère en raison d'un manque de résidus d'acides aminés responsables du contact avec RI. Seuls trois résidus qui entrent en contact avec RI dans la RNase A sont conservés dans l'onconase (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K. J. Biol. Chem. 1991 ; 266: 245-251Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Kobe B. Diesenhofer J. Nature. 1995 ; 374: 183-186Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar). L'IR est une protéine de 50 kDa qui constitue 0,01 % de la protéine cytosolique totale et est une protéine hautement conservée chez diverses espèces de mammifères (25Lee F.S. Vallee B.L. Prog. Nucleic Acids Res. 1993 ; 44: 1-30Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 26Hofsteenge J. D'Alessio G. Riordan J.F. Ribonucleases : Structures and Functions. Academic Press, New York1997: 621-658Crossref Google Scholar). RI forme un complexe non covalent 1:1 avec la RNase A ; et comme on le voit à partir de la structure tridimensionnelle du complexe pRI ·RNase A, un tiers de l'enzyme, y compris son site actif, se trouve dans la structure en forme de fer à cheval de l'inhibiteur (27Kobe B. Diesenhofer J. J. Mol. Biol. 1996 ; 264: 1028-1043Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar). Une interaction similaire a été observée avec l'angiogénine et le RI humain (hRI) ; cependant, les contacts intermoléculaires dans le complexe RI·RNase diffèrent en raison des différences dans les séquences des deux RNases (28Papageorgiou A.C. Shapiro R. Acharya K.R. EMBO J. 1997 ; 16: 5162-5177Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar). Récemment, la structure cristalline d'un variant de HPR, ayant cinq résidus amino-terminaux remplacés par ceux de la BS-RNase, a été déterminée (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000 ; 303: 49-59Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). La structure de cette variante HPR partage la taille globale et la forme caractéristique en V des autres RNases de sa famille ; cependant, elle diffère significativement de la RNase A dans diverses régions de boucle (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000 ; 303: 49-59Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Il a été démontré récemment que la RNase A peut être modifiée comme une cytotoxine en mutant le résidu de contact spécifique Gly-88, ce qui a entraîné une diminution de sa sensibilité à l'inactivation de RI (30LELAND P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998 ; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Parce que la puissance d'une RNase cytotoxique peut être définie en termes d'affinité pour l'IR, il est possible que l'HPR puisse être transformée en cytotoxine en diminuant sa sensibilité à l'inactivation de l'IR. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle de quatre résidus de contact plausibles dans la HPR dans son interaction avec l'hRI dans le but de générer des variants cytotoxiques de la HPR. Nous avons généré des variants de HPR qui ont une résistance accrue à l'inactivation par l'hRI et sont plus cytotoxiques. HPR est une protéine constituée de 128 résidus d'acides aminés. pHPR, un plasmide contenant le gène HPR à 384 paires de bases, cloné en aval d'un promoteur T7 (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar), a été utilisé comme modèle pour muter les résidus cibles Lys-7, Gln-11, Asn-71 et Glu-111 en Ala. De même, les résidus Asn-88, Gly-89 et Ser-90 ont été mutés en arginine. À l'exception de K7A, toutes les mutations ont été effectuées par mutagenèse dirigée par oligonucléotide (31Kunkel T.A. Roberts J.D. Zakour R.A. Methods Enzymol. 1987 ; 154: 367-382Crossref PubMed Scopus (4560) Google Scholar). La matrice d'ADN contenant de l'uracile a été préparée en infectant la souche CJ236 d'Escherichia coli avec le phage recombinant et en le cultivant en présence d'uridine et de chloramphénicol (31Kunkel T.A. Roberts J.D. Zakour R.A. Methods Enzymol. 1987 ; 154: 367-382Crossref PubMed Scopus (4560) Google Scholar). La mutagenèse a été réalisée en utilisant les amorces d'ADN JKB 8, JKB 9, JKB 10, JKB 11, JKB 15, JKB 16 et JKB 29 contenant les mutations G89R, N88R, K7A, Q11A, N71A, E111A et S90R, respectivement. Les séquences des différentes amorces utilisées sont présentées dans le tableau I. Les produits d'extension des amorces ont été transformés en souche DH5α d'E. coli par des méthodes standard. Le mutant K7A a été construit par réaction en chaîne de la polymérase en utilisant pHPR comme matrice, JKB 10 comme amorce directe et une amorce inverse universelle EcoRI. Les amorces ont été conçues de telle sorte que le fragment HPR amplifié portant la mutation K7A avait des sites de reconnaissance pour NheI à l'extrémité 5′ et EcoRI à l'extrémité 3′. Le fragment amplifié a été digéré avec NheI et EcoRI, purifié par électrophorèse sur gel, et cloné dans un promoteur T7 basé sur E. coliexpression vecteur pVEX11 restreint avec les mêmes enzymes. pVEX11 est un vecteur à base de pUC qui a un promoteur de phage T7, de multiples sites de clonage, et un terminateur de transcription T7.Table ISequence d'amorces utilisées pour la mutagenèse des résidus putatifsMutantPrimerSequenceK7AJKB 105'-ATGGCTAGCAAGGAATCCCGGGCCAAGgctTTCCAGCGGG-3' Q11AJKB 115 '-ACTGTCTGAGTCCATGagcCCGCTGGAATTTCTTGGC-3' N71AJKB 155 '-GGAGTTGCTCTTGTAGCAagcGCCCTGCCCGTTCTTGCA-3' E111AJKB 165 '-TGGCACATGGCCCagcACAGACCCAGATGATGATTGTG-3' N88RJKB 95 '-GTTGGGTACGTGTCGAGTCTGTCGGTCAGTCTGTCGGTCTGGGTCGTGTGTCGTCGTG89' GACGGTGGTCGTCGGTCGGTCGGTCGGTCGGGTCGGTCGGTCGGGTCGTCGGGTCGGTCGGTCGTCGTCGGTCGTCGGTCGGTCGTCGTCGTCGACAGTCGGTCGTCGTCGGTCGTCGTCGTCGGGTCGTCGTCGGTCGTCGGTCGTCGGTCGGGTCGTCGGGTCGTCGGGTCGTCGTCGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGGTCGTCGTCGGTCGTCGGGGTCGTCGTCGGTCGTCGTCGGGGTCGGTCGGGTCGTCGTCGTCGGGGTCGTCGTCGTCGTCGGTCGGGGGGTCGTCGGGGTCGTCGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGGTCGTCGGGGTCGGGGGTCGGGGGGTCGTCGTCGTCGGGGGGGGGGTCGTCGGTCGGGGGGTCGGTCGTCGGGTCGTCGTCGGGGGTCGTCGTCGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGGGGGGGGG Ouvrir la table dans un nouvel onglet Les lettres soulignées en minuscules représentent les nucléotides mutés. Pour construire les mutants doubles K7A/E111A, Q11A/E111A et N71A/E111A, les mutants K7A, Q11A, N71A et E111A ont été digérés avec NheI (présent à l'extrémité 5′) et KpnI (présent à la position 292 dans le gène HPR), et le fragment de 290 paires de bases libéré des mutants a été ligaturé avec le fragment de vecteur NheI-KpnI obtenu à partir du mutant E111A. Le triple mutant K7A/N71A/E111A a été préparé en mutant le Lys-7 en Ala par réaction en chaîne de la polymérase comme mentionné ci-dessus, en utilisant le double mutant N71A/E111A comme matrice. Le triple mutant Q11A/N71A/E111A a été créé par mutagenèse dirigée par oligonucléotide en utilisant le double mutant N71A/E111A comme matrice et amorce JKB 11. Pour la construction du quadruple mutant K7A/Q11A/N71A/ E111A, le triple mutant Q11A/N71A/E111A a été utilisé comme matrice, et la mutation K7A a été introduite par réaction en chaîne de la polymérase. Toutes les mutations ont été confirmées par séquençage de l'ADN en utilisant la méthode de terminaison de chaîne didéoxy (32Sanger F. Niklen S. Coulson A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977 ; 74: 5463-5467Crossref PubMed Scopus (52771) Google Scholar). La HPR a été surexprimée plus tôt chez E. coli et purifiée à partir des corps d'inclusion pour obtenir une enzyme fonctionnellement active (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Les protéines mutantes HPR ont été préparées de manière similaire à partir des cultures de la souche E. coli BL21(λDE3), transformées avec un plasmide approprié, et cultivées dans un superbroth contenant 100 μg/ml d'ampicilline (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Tous les mutants HPR se sont accumulés dans les corps d'inclusion cytoplasmiques qui ont été traités plus avant comme décrit (33Buchner J. Pastan I. Brinkmann U. Anal. Biochem. 1992 ; 205: 263-270Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar). La solubilisation du culot du corps d'inclusion a été réalisée dans 6 m de chlorhydrate de guanidium. La renaturation de la protéine solubilisée a été effectuée en diluant la protéine dans un tampon de repliement contenant de la l-arginine et du glutathion oxydé. La protéine renaturée, après dialyse, a été chargée sur une colonne échangeuse de cations S-Sépharose. La protéine a été éluée avec un gradient de NaCl 0–1 m et purifiée davantage par chromatographie de filtration sur gel (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Les spectres CD des protéines purifiées ont été enregistrés à l'aide d'un dichrographe Jasco J720 (Easton) dans la région des UV lointains (190–250 nm). Chaque protéine, 33 μg/ml dans du phosphate de sodium de 10 mm, pH 7,0, a été utilisée dans une cellule avec un chemin optique de 1 cm pour enregistrer les spectres. Les spectres ont été acquis à une vitesse de balayage de 50 nm/min avec une sensibilité de 50 mdeg et un temps de réponse de 1 s. Les spectres mesurés étaient une moyenne de 10 accumulations, et les résultats sont présentés comme des valeurs moyennes d'ellipticité résiduelle. L'activité ribonucléolytique de divers mutants a été testée sur des substrats poly(C), poly(U), ARNt de levure et poly(A·U) comme décrit par Bond (34Bond M.D. Anal. Biochem. 1988 ; 173: 166-173Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Chaque substrat (40 μg) a été incubé séparément avec différentes concentrations de l'HPR de type sauvage ou de ses mutants dans du Tris-HCl 100 mm, pH 7,5, pendant 1 h à 37 °C. L'ARN de grand poids moléculaire non digéré a été précipité avec de l'acide perchlorique et de l'acétate d'uranyle sur de la glace et éliminé par centrifugation à 15 000 × g pendant 10 min. Le produit soluble dans l'acide a été quantifié en mesurant l'absorbance à 260 nm. L'activité hydrolytique de l'HPR et de ses mutants sur la CMP cyclique a été dosée selon la méthode de Crook et al. (35Crook E.M. Mathias A.P. Rabin B.R. Biochem. J. 1960 ; 74: 234-238Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar). Dans un tampon de réaction composé de 0,2 m Tris-HCl, pH 7,5 et 0,02 m EDTA, 0,1 mg/ml de CMP cyclique a été mélangé avec 40 μg/ml de l'enzyme, et la réaction a été suivie spectrophotométriquement à 284 nm à 25 °C. L'activité RNase de diverses protéines sur les substrats dinucléotidiques CpA, UpA et UpG a été mesurée en utilisant la procédure de Witzel et Barnard (36Witzel H. Barnard e.a. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962 ; 7: 295-299Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). Le substrat approprié, 50 μm en tampon Tris-HCl 100 mm, pH 7,0, a été incubé avec HPR ou ses mutants (concentration finale 5 μm) à 25 °C. L'évolution de l'absorbance à 284 nm a été suivie spectrophotométriquement. Les mutants HPR ont été criblés pour l'activité ribonucléolytique en présence de hRI en utilisant un test à base de gel d'agarose (30LELAND P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998 ; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Brièvement, dans un volume total de 10 μl, 10 ng d'enzyme ont été mélangés avec 4 μg d'ARN hépatique total de rat et 20 unités d'hRI recombinant dans du Tris-HCl de 100 mm, pH 7,5, contenant 10 mm de dithiothréitol. Le mélange a été incubé pendant 10 min à 37 °C ; la réaction a été arrêtée par l'ajout de 2 μl de tampon de chargement de gel contenant 10 mm de Tris-HCl, pH 7,5, 50 mm d'EDTA, du glycérol (30 % v/v), du xylène cyanol FF (0,25 % p/v) et du bleu de bromphénol (0,25 % p/v) et soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5 % contenant du bromure d'éthidium. L'activité RNase des mutants, en présence de RI, a été étudiée quantitativement en dosant leur activité sur le substrat homopolymère d'ARN le plus préféré, le poly(C), dans un test décrit ci-dessus (34Bond M.D. Anal. Biochem. 1988 ; 173: 166-173Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Les constantes d'inhibition (K i ) pour les interactions mutantes RI-HPR ont été déterminées en mesurant le taux de clivage du poly(C) à l'état d'équilibre en présence de RI. Les réactions ont été réalisées dans du Tris-HCl 100 mm, pH 7,5, contenant 2,8 nm d'enzyme et 50–300 μm de poly(C). Les concentrations de RI dans la plage 300–700 pm ont été utilisées, et les données de vitesse initiales ont été utilisées pour préparer des tracés Lineweaver-Burk, à partir desquels K i a été calculé. Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur cinq lignées cellulaires différentes : U373MG (glioblastome humain), J774A.1 (monocyte-macrophage de souris), K562 (érythroleucémie humaine), A431 (carcinome épidermoïde humain) et A549 (carcinome pulmonaire humain). La cytotoxicité a été évaluée en mesurant l'incorporation de [3H]leucine dans la protéine nouvellement synthétisée. Les cellules ont été incubées avec des RNases pendant 40 h, suivies d'un pouls de 3 h avec 0,75 μCi/puits de [3H]leucine. Les cellules ont ensuite été récoltées sur des filtres en fibre de verre à l'aide d'une moissonneuse de cellules. Les filtres ont été séchés et les comptages ont été effectués à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. Les valeurs de la DI50 représentent la concentration de la RNase qui a inhibé la synthèse des protéines cellulaires de 50 %. L'objectif de l'étude était de déterminer si l'affinité de l'HPR pour l'IR pouvait être réduite par la mutation de résidus de contact spécifiques, probablement impliqués dans la liaison de l'HPR à l'IR. Nous avons sélectionné les résidus cibles dans HPR en fonction de deux critères. Tout d'abord, le résidu doit être impliqué dans la liaison de HPR avec RI en formant une liaison hydrogène ou un contact de van der Waal avec RI, tel que défini par la structure cristalline du complexe RI·RNase. Deuxièmement, le résidu cible ne doit pas être impliqué dans le site actif de la HPR. Sur la base d'études d'homologie avec les résidus impliqués dans la liaison RI de plusieurs RNases, en particulier la RNase A, nous avons sélectionné quatre résidus cibles en HPR : Lys-7, Gln-11, Asn-71 et Glu-111. Nous avons remplacé ces résidus dans HPR par de l'alanine pour produire les mutants K7A, Q11A, N71A et E111A. L'alanine a été choisie car elle élimine la chaîne latérale au-delà du carbone β sans altérer la conformation principale. Nous avons combiné les mutations simples pour former trois mutants doubles, K7A/E111A, Q11A/E111A et N71A/E111A ; deux mutants triples, K7A/N71A/E111A et Q11A/N71A/E111A ; et un mutant quadruplet, K7A/Q11A/N71A/E111A. Dans la RNase A, il a été démontré que la mutation de Gly-88 en Arg diminue sa sensibilité à l'inactivation de RI et augmente par conséquent la puissance cytotoxique de plusieurs fois (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998 ; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Le Gly-88 dans la RNase A est homologue au Gly-89 dans la HPR. Dans la présente étude, nous avons muté individuellement Gly-89 et aussi Asn-88 et Ser-90 en Arg, donnant trois mutants simples, N88R, G89R et S90R. Les mutants ont été exprimés dans E. coli, et les protéines surexprimées, isolées des corps d'inclusion, ont été purifiées jusqu'à homogénéité grâce à un schéma de purification en deux étapes comprenant l'échange de cations et la chromatographie de filtration sur gel. Les mutants HPR purifiés ont migré sur électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide sous forme de bandes uniques correspondant à leurs poids moléculaires attendus (Fig.1 A). Un anticorps polyclonal contre la HPR a réagi avec les 13 protéines mutantes aussi bien que le montrent les Western blots (Fig. 1 B). Les rendements finaux typiques des protéines recombinantes purifiées étaient de l'ordre de 10–20 mg/litre de culture. La caractérisation structurale a été réalisée par analyse spectrale de la MC pour étudier l'effet des mutations sur la conformation globale de l'HPR. Comme le montre la figure 2, la HPR recombinante semble être pliée de manière compacte avec une conformation α+β. Les spectres CD des protéines mutantes K7A, Q11A, N71A et E111A (Fig. 2 A) ; K7A/E111A, Q11A/E111A et N71A/E111A (Fig. 2 B) ; K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A et K7A/Q11A/N71A/E111A (Fig. 2 C) ; et N88R et G89R (Fig.2 D) ont indiqué une altération modeste ; cependant, la structure globale semble être similaire à celle de la protéine de type sauvage. La conformation de S90R (Fig. 2 D) a été trouvé altéré par rapport à l'HPR de type sauvage, montrant une diminution significative du contenu hélicoïdal α du mutant. L'activité RNase des sept mutants alanine simples a été testée sur trois substrats d'ARN différents : poly(C), ARNt de levure et CMP cyclique. Les RNases pancréatiques ont une préférence pour les substrats d'ARN riches en pyrimidine. Sur le substrat homopolymère de pyrimidine simple brin, poly(C), les mutants K7A, Q11A, N71A et E111A ont montré une activité similaire ou supérieure par rapport à l'HPR de type sauvage (TableauII). Sur l'ARNt de levure, le mutant K7A a montré une activité de 78% par rapport à l'enzyme de type sauvage, tandis que les mutants Q11A, N71A et E111A ont montré une activité environ 50% plus faible (Tableau II). L'activité hydrolytique de l'HPR et de ses mutants a été étudiée par suivi spectrophotométrique de la dégradation de la CMP cyclique en 3′-monophosphate. Les mutants K7A, Q11A, N71A et E111A se sont avérés posséder une activité hydrolytique similaire à celle de la HPR de type sauvage (Tableau II).Tableau IIActivité catalytique des mutants HPRProtéineΔA/min/mg de protéinePoly (C) ARNt de levureCMPCpAUpAUpGHPR227 000 (100)16 300 (100)0,37 (100) 0,1400,138NDK7A241 000 (106)12 800 (78)0,45 (121) 0,1480,130NDQ11A186 000 (82)7 950 (48)0,29 (78) 0,1300,020NDN71A313 000 (140)7 600 (46)0,67 (181) 0,1200,0500,280E111A508 000 (224)8 800 (53) 0,54 (145) 0,1300,0770,070Substrats poly(C), ARNt de levure et cMPC ont été incubés séparément avec différentes concentrations du type sauvage ou de ses mutants HPR pendant 1 h à 37 °C. L'ARN de grand poids moléculaire non digéré a été précipité avec de l'acide perchlorique et de l'acétate d'uranyle sur de la glace et éliminé par centrifugation. Le produit soluble dans l'acide a été quantifié en mesurant l'absorbance à 260 nm. Chaque substrat dinucléotidique a été incubé avec HPR et ses mutants à 25 °C. L'évolution de l'absorbance à 284 nm a été suivie spectrophotométriquement. L'activité spécifique a été exprimée en ΔA/min/mg de protéine. Le pourcentage d'activité par rapport à l'activité HPR est indiqué entre parenthèses. ND, non déterminable. Table ouverte dans un nouvel onglet Les substrats poly(C), ARNt de levure et cCMP ont été incubés séparément avec différentes concentrations de l'HPR de type sauvage ou de ses mutants pendant 1 h à 37 °C. L'ARN de grand poids moléculaire non digéré a été précipité avec de l'acide perchlorique et de l'acétate d'uranyle sur de la glace et éliminé par centrifugation. Le produit soluble dans l'acide a été quantifié en mesurant l'absorbance à 260 nm. Chaque substrat dinucléotidique a été incubé avec HPR et ses mutants à 25 °C. L'évolution de l'absorbance à 284 nm a été suivie spectrophotométriquement. L'activité spécifique a été exprimée en ΔA/min/mg de protéine. Le pourcentage d'activité par rapport à l'activité HPR est indiqué entre parenthèses. ND, non déterminable. Les mutants K7A, Q11A, N71A et E111A présentaient une activité similaire à l'enzyme de type sauvage sur le substrat dinucléotidique CpA le plus favorisé (Tableau II). Sur UpA, le mutant K7A a montré une activité similaire à celle de HPR, mais il y avait une perte significative d'activité des mutants Q11A, N71A et E111A (Tableau II). Sur le substrat dinucléotidique UpG, comme HPR, les mutants K7A et Q11A se sont également révélés inactifs, tandis que les mutants N71A et E111A présentaient une activité RNase, la N71A étant plus active (Tableau II). Sur le poly(C), par rapport à l'HPR, le mutant N71A/E111A s'est avéré avoir une activité 3 fois plus élevée (Tableau III). L'activité des mutants N88R, G89R, S90R, K7A/E111A et K7A/N71A/E111A s'est avérée similaire à celle des mutants HPR de type sauvage sur poly(C), alors que les mutants Q11A/E111A, Q11A/N71A/E111A et K7A/Q11A/N71A/E111A présentaient une très faible activité RNase (Tableau III).Tableau IIICactivité catalytique des mutants HPR sur la protéine poly(C) ΔA/min/mg protéineHPR227,000 (100)K7A/E111A292,000 (128)Q11A/E111A80,000 (35) N71A/E111A688,000 (303)K7A/N71A/E111A262,000 (115)Q11A/N71A/E111A48,000 (21)K7A/Q11A/N71A/E111A48,000 (21) N88R237,000 (104) G89R220,000 (97) S90R232,500 (102)Le substrat poly(C) a été incubé avec différentes concentrations de type sauvage et ses mutants HPR pour 1 h à 37 °C. L'ARN de grand poids moléculaire non digéré a été précipité avec de l'acide perchlorique et de l'acétate d'uranyle sur de la glace et éliminé par centrifugation. Le produit soluble dans l'acide a été quantifié en mesurant l'absorbance à 260 nm. L'activité spécifique a été exprimée en ΔA/min/mg de protéine. Le pourcentage d'activité par rapport à l'activité HPR est indiqué entre parenthèses. Table ouverte dans un nouvel onglet Le substrat poly(C) a été incubé avec différentes concentrations de l'HPR de type sauvage et de ses mutants pendant 1 h à 37 °C. L'ARN de grand poids moléculaire non digéré a été précipité avec de l'acide perchlorique et de l'acétate d'uranyle sur de la glace et éliminé par centrifugation. Le produit soluble dans l'acide a été quantifié en mesurant l'absorbance à 260 nm. L'activité spécifique a été exprimée en ΔA/min/mg de protéine. Le pourcentage d'activité c

Las ribonucleasas de mamíferos interactúan muy fuertemente con el inhibidor intracelular de ribonucleasas (RI). Las células eucariotas expuestas a ribonucleasas de mamífero están protegidas de su acción citotóxica por la inhibición intracelular de ribonucleasas por RI. La ribonucleasa pancreática humana (HPR) es estructural y funcionalmente muy similar a la RNasa A bovina e interactúa con la RI humana con una alta afinidad. En el estudio actual, hemos investigado la participación de Lys-7, Gln-11, Asn-71, Asn-88, Gly-89, Ser-90 y Glu-111 en HPR en su interacción con el inhibidor de ribonucleasa humana. Estos residuos de contacto se mutaron individualmente o en combinación para generar los mutantes K7A, Q11A, N71A, E111A, N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A y K7A/Q11A/N71A/E111A. De estos, ocho mutantes, K7A, Q11A, N71A, S90R, E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A y K7A/N71A/E111A, mostraron una capacidad para evadir RI más que la HPR de tipo salvaje, con el triple mutante K7A/N71A/E111A que tiene la máxima resistencia a RI. Como resultado, estas variantes mostraron una mayor actividad citotóxica que la HPR de tipo salvaje. La mutación de Gly-89 en HPR no produjo ningún cambio en la sensibilidad de HPR para RI, mientras que se ha informado que la mutación del residuo equivalente Gly-88 en RNasa A produjo una variante con mayor resistencia a RI y citotoxicidad. Por lo tanto, a pesar de su considerable homología con la RNasa A, la HPR muestra diferencias en su interacción con la RI. Demostramos que la interacción entre la ribonucleasa pancreática humana y RI puede interrumpirse mediante la mutación de residuos que están involucrados en la unión de HPR-RI. Los mutantes de HPR citotóxicos resistentes a inhibidores deberían ser útiles en el desarrollo de moléculas terapéuticas. Las ribonucleasas de mamíferos interactúan muy fuertemente con el inhibidor intracelular de ribonucleasas (RI). Las células eucariotas expuestas a ribonucleasas de mamífero están protegidas de su acción citotóxica por la inhibición intracelular de ribonucleasas por RI. La ribonucleasa pancreática humana (HPR) es estructural y funcionalmente muy similar a la RNasa A bovina e interactúa con la RI humana con una alta afinidad. En el estudio actual, hemos investigado la participación de Lys-7, Gln-11, Asn-71, Asn-88, Gly-89, Ser-90 y Glu-111 en HPR en su interacción con el inhibidor de ribonucleasa humana. Estos residuos de contacto se mutaron individualmente o en combinación para generar los mutantes K7A, Q11A, N71A, E111A, N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A y K7A/Q11A/N71A/E111A. De estos, ocho mutantes, K7A, Q11A, N71A, S90R, E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A y K7A/N71A/E111A, mostraron una capacidad para evadir RI más que la HPR de tipo salvaje, con el triple mutante K7A/N71A/E111A que tiene la máxima resistencia a RI. Como resultado, estas variantes mostraron una mayor actividad citotóxica que la HPR de tipo salvaje. La mutación de Gly-89 en HPR no produjo ningún cambio en la sensibilidad de HPR para RI, mientras que se ha informado que la mutación del residuo equivalente Gly-88 en RNasa A produjo una variante con mayor resistencia a RI y citotoxicidad. Por lo tanto, a pesar de su considerable homología con la RNasa A, la HPR muestra diferencias en su interacción con la RI. Demostramos que la interacción entre la ribonucleasa pancreática humana y RI puede interrumpirse mediante la mutación de residuos que están involucrados en la unión de HPR-RI. Los mutantes de HPR citotóxicos resistentes a inhibidores deben ser útiles en el desarrollo de moléculas terapéuticas. ribonucleasa seminal bovina inhibidor de ribonucleasa pancreática humana inhibidor de ribonucleasa humana Las ribonucleasas de mamíferos constituyen una superfamilia ubicua de proteínas con un alto nivel de divergencia estructural y funcional. Estos incluyen un grupo de proteínas homólogas aisladas de muchas fuentes de mamíferos, aves, reptiles y anfibios y se sabe colectivamente que forman parte de la superfamilia de la RNasa A (1Beintema J.J. Breukelman H.J. Carsana A. Furia A. D'Alessio G. Riordan J.F. Ribonucleases : Structures and Functions. Academic Press, Nueva York1997: 245-269Crossref Google Scholar). El actual resurgimiento del interés en las RNasas es el resultado del descubrimiento de RISBASES (RNasas con Acciones Biológicas Especiales), que se ha identificado que influyen en el crecimiento de las células tumorales, el desarrollo neurológico y la diferenciación biológica (2D'Alessio G. Trends Cell Biol. 1993; 3: 106-109Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). Una función biológica importante de las RNasas de mamífero puede ser la defensa del huésped, como se ha observado en el caso de las dos RNasas de eosinófilos, la proteína catiónica de eosinófilos y la neurotoxina derivada de eosinófilos, que exhiben actividades antivirales, antibacterianas, antiparasitarias y neurotóxicas (3Domachowske J.B. Rosenberg H.F. J. Leukocyte Biol. 1997; 62: 363-368Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar, 4Lehrer R.I. Szklarek D. Barton A. Ganz T. Hamann K.J. Gleich G.J. Immunol. 1989; 142: 4428-4434PubMed Google Scholar, 5Rosenberg H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7876-7881Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar, 6Durack D.T. Ackerman S.J. Loegering D.A. Gleich G.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981; 78: 5165-5169Crossref PubMed Scopus (185) Google Scholar, 7Newton D.L. Walbridge S. Mikulski S.M. Ardelt W. Shogen K. Ackerman S.J. Rybak S.M. Youle R.J. J. Neurosci. 1994; 14: 538-544 Crossref PubMed Google Scholar). Además, la RNasa onconasa de rana y la ribonucleasa seminal bovina (BS-RNasa)1 exhiben actividad antitumoral (8Nitta K. Ozaki K. Ishikawa M. Furusawa S. Hosono M. Kawauchi H. Sasaki K. Takayanagi Y. Tsuiki S. Hakomori S. Cancer Res. 1994; 54: 920-927PubMed Google Scholar, 9Mikulski S.M. Grossman A.M. Carter P.W. Shogen K. Costanzi J.J. Int. J. Oncol. 1993; 3: 57-64PubMed Google Scholar, 10Vescia S. Tramontano D. Augusti-Tocco G. D'Alessio G. Cancer Res. 1980; 40: 3740-3744PubMed Google Scholar, 11Laccetti P. Portella G. Mastronicola M.R. Russo A. Piccoli R. D'Alessio G. Vecchio G. Cancer Res. 1992; 52: 4582-4586PubMed Google Scholar). La ribonucleasa pancreática humana (HPR) es de naturaleza secretora y se ha considerado como una contraparte de la RNasa A pancreática bovina (12Beintema J.J. Wietzes P. Weickmann J. Glitz J.J. Anal. Biochem. 1984; 136: 48-64Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 13Seno M. Futami J. Kosaka M. Seno S. Yamada H. Biochim. Biophys. Acta. 1994; 1218: 466-468Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar). Aunque HPR comparte un 70% de homología con la RNasa A y posee residuos estructurales y catalíticos clave similares, muestra algunas características únicas (14Weickmann J.L. Elson M. Glitz D.G. Biochemistry. 1981; 20: 1272-1278 Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar). HPR posee una actividad sustancial contra el ARN bicatenario, contiene una mayor proporción de residuos básicos, su actividad está influenciada diferencialmente por la fuerza iónica y los iones divalentes, y en comparación con la RNasa A tiene una extensión carboxilo-terminal de cuatro residuos, EDST (15Bardon ' A. Sierakowska H. Shugar D. Biochim. Biophys. Acta. 1976; 438: 461-473Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 16Sorrentino S. Libonati M. Arch. Biochem. Biophys. 1994; 312: 340-348Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar, 17Sorrentino S. Glitz D.G. Hamann K.J. Loegering D.A. Checkel J.L. Gleich G.J.J. Biol. Chem. 1992; 267: 14859-14865Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Hemos informado anteriormente que la eliminación de la extensión EDST carboxilo-terminal mejora la actividad RNasa y la termoestabilidad de HPR (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Aunque tanto la RNasa A como la HPR catalizan la degradación del ARN de manera eficiente, no se han asociado con ninguna acción biológica especial y, por lo tanto, su papel fisiológico, especialmente el de la HPR, no está claramente definido. Las ARNasas tienen mucho potencial como agentes quimioterapéuticos. La onconasa se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase III en humanos para el tratamiento de la mesotelemia maligna (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K. J. Biol. Chem. 1991; 266: 245-251Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) y también se ha demostrado que inhibe la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo I en células humanas infectadas crónicamente (20Saxena S.K. Gravell M. Wu Y.-N. Mikulski S.M. Shogen K. Ardelt W. Youle R.J.J. Biol. Chem. 1996; 271: 20783-20788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (79) Google Scholar). La mayoría de las RNasas pancreáticas, con la excepción de BS-RNasa y onconasa, no son citotóxicas. La principal razón aparente de esta mala citotoxicidad es la neutralización de la actividad ribonucleolítica de las RNasas por el inhibidor citosólico de la RNasa (RI). Por lo tanto, la afinidad de una RNasa por el RI intracelular podría desempeñar un papel importante en la definición de su potencia citotóxica. La HPR es muy prometedora como agente terapéutico para humanos y, en comparación con otras RNasas, es probable que sea menos inmunogénica y, por lo tanto, más eficaz. Cuando las RNasas "no citotóxicas" sensibles a RI se inyectan directamente en xenopusocitos, que carecen de inhibidores fuertes para las RNasas de mamíferos, muestran una actividad citotóxica comparable a la ricina y la toxina diftérica (21Saxena S.K. Rybak S.M. Winkler G. Meade H.M. McGray P. Youle R.J. Ackerman E.J. J. Biol. Chem. 1991; 266: 21208-21214Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Además, se encuentra que las dos clases de RNasas con actividad anticancerígena, onconasa y BS-RNasa, son resistentes a la proteína RI citosólica, y sus actividades citotóxicas parecen ser una consecuencia de sus capacidades para escapar de la inactivación por RI. (22Wu Y.N. Mikulski S.M. Ardelt W. Rybak S.M. Youle R.J.J. Biol. Chem. 1993; 268: 10686-10693Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992; 281: 343-348Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). La BS-RNasa es un homodímero de origen natural que se estabiliza mediante dos puentes disulfuro intersubunitarios. El monómero de BS-RNasa es altamente homólogo a la RNasa A; sin embargo, la forma dimérica tiene una afinidad mucho menor por RI que el monómero libre (23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992; 281: 343-348Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). La onconasa evade el RI como monómero debido a la falta de residuos de aminoácidos que son responsables de hacer contacto con el RI. Solo tres residuos que entran en contacto con RI en RNasa A se conservan en onconasa (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K. J. Biol. Chem. 1991; 266: 245-251Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Kobe B. Diesenhofer J. Nature. 1995; 374: 183-186Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar). RI es una proteína de 50 kDa que constituye el 0,01% de la proteína citosólica total y es una proteína altamente conservada en varias especies de mamíferos (25Lee F.S. Vallee B.L. Prog. Nucleic Acids Res. 1993; 44: 1-30Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 26Hofsteenge J. D'Alessio G. Riordan J.F. Ribonucleases : Structures and Functions. Academic Press, Nueva York1997: 621-658Crossref Google Scholar). RI forma un complejo no covalente 1:1 con RNasa A; y como se ve en la estructura tridimensional del complejo pRI ·RNasa A, un tercio de la enzima, incluido su sitio activo, se encuentra dentro de la estructura en forma de herradura del inhibidor (27Kobe B. Diesenhofer J. J. Mol. Biol. 1996; 264: 1028-1043Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar). Se ha observado una interacción similar con angiogenina y RI humano (hRI); sin embargo, los contactos intermoleculares en el complejo RI·RNasa difieren debido a las diferencias en las secuencias de las dos RNasas (28Papageorgiou A.C. Shapiro R. Acharya K.R. EMBO J. 1997; 16: 5162-5177Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar). Recientemente, se ha determinado la estructura cristalina de una variante de HPR, que tiene cinco residuos amino-terminales reemplazados por los de la BS-RNasa (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000; 303: 49-59Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). La estructura de esta variante de HPR comparte el tamaño general y la forma de V característica de las otras RNasas de su familia; sin embargo, difiere significativamente de la RNasa A en varias regiones de bucle (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000; 303: 49-59Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Recientemente se ha demostrado que la RNasa A se puede diseñar como una citotoxina mediante la mutación del residuo de contacto específico Gly-88, lo que condujo a una disminución en su susceptibilidad a la inactivación de RI (30LELAND P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Debido a que la potencia de una RNasa citotóxica se puede definir en términos de su afinidad por la RI, es posible que la HPR se pueda transformar en una citotoxina al reducir su sensibilidad a la inactivación de la RI. En el presente estudio hemos investigado el papel de cuatro residuos de contacto plausibles en HPR en su interacción con el hRI con el objetivo de generar variantes citotóxicas de HPR. Hemos generado variantes de HPR que tienen una mayor resistencia a la inactivación por el hRI y son más citotóxicas. HPR es una proteína que consiste en 128 residuos de aminoácidos. pHPR, un plásmido que contiene el gen HPR de 384 pares de bases, clonado corriente abajo de un promotor T7 (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar), se utilizó como plantilla para mutar los residuos diana Lys-7, Gln-11, Asn-71 y Glu-111 a Ala. De manera similar, los residuos Asn-88, Gly-89 y Ser-90 se mutaron a arginina. Excepto para K7A, todas las mutaciones se llevaron a cabo mediante mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótidos (31Kunkel TA Roberts JD Zakour RA Methods Enzymol. 1987; 154: 367-382 Crossref PubMed Scopus (4560) Google Scholar). El molde de ADN que contiene uracilo se preparó infectando la cepa CJ236 deEscherichia coli con el fago recombinante y cultivándolo en presencia de uridina y cloranfenicol (31Kunkel TA Roberts JD Zakour RA Methods Enzymol. 1987; 154: 367-382 Crossref PubMed Scopus (4560) Google Scholar). La mutagénesis se realizó utilizando los cebadores de ADN JKB 8, JKB 9, JKB 10, JKB 11, JKB 15, JKB 16 y JKB 29 que contienen las mutaciones G89R, N88R, K7A, Q11A, N71A, E111A y S90R, respectivamente. Las secuencias de varios cebadores utilizados se muestran en la Tabla I. Los productos de extensión de cebadores se transformaron en la cepa DH5α de E. coli mediante métodos estándar. El mutante K7A se construyó mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando pHPR como plantilla, JKB 10 como cebador directo y un cebador inverso EcoRI universal. Los cebadores se diseñaron de modo que el fragmento de HPR amplificado que portaba la mutación K7A tuviera sitios de reconocimiento para NheI en el extremo 5'y EcoRI en el extremo 3'. El fragmento amplificado se digirió con NheI y EcoRI, se purificó mediante electroforesis en gel y se clonó en un vector de expresión de coliexpresión pVEX11 basado en el promotor T7 restringido con las mismas enzimas. pVEX11 es un vector basado en pUC que tiene un promotor de fago T7, múltiples sitios de clonación y un terminador de transcripción T7. Tabla I Secuencia de cebadores utilizados para la mutagénesis de los residuos putativosMutantPrimerSequenceK7AJKB 105′ -ATGGCTAGCAAGGAATCCCGGGCCAAGgctTTCCAGCGG-3 ′ Q11AJKB 115′ -ACTGTCTGAGTCCATATGagcCCGCTGGAATTTCTTGGC-3 ′ N71AJKB 155 ′ -GGAGTTGCTCTTGTAGCAagcGCCCTGCCCTTCTTGCA-3 ′ E111AJKB 165 ′ -TGGCACATATGGCCCTGCCCagcACAGCCACAGCCATGATGTGT-388RJB ′ 95GGTTGTAGCCTCCGCCTGCCGcTTCTTCTTCTGCAGCAG-3 ′ E111AJKB 165 ′ -TGGCACATATGGCCCTGCCTGCGCCTGCGCCTGAGCAGCAGCAGCATCCGCAGCAGCAGCAGCATCCGAGAGAGATGATGATGATGATGAGGATGATGCATGATGGATGAGCATGATGAGCATGAGCATGAGCATGATGAGCATGATGATGATGAGGATGATGAGGAGCATGATGAGGATGATCATGATCATCATCATGAGGATCATGATGATGATGAGGAGGATCATCATCATCATCATGATCATGAGGAGGATCATCATGAGGATCATGAGGAGGAGGATGATGATCATGATGATCATCATCATGATGATGATGATCATGAGGATCATCATCATGATCATCATGATGAGGAGGAGGATCATGATCATCATCATCATCATGATGATGATCATCATCATGATGAGGATCATCATGATCATGATGATCATGATCATGATCAT Abrir tabla en una nueva pestaña Las letras subrayadas en minúsculas representan los nucleótidos mutados. Para construir los mutantes dobles K7A/E111A, Q11A/E111A y N71A/E111A, los mutantes K7A, Q11A, N71A y E111A se digirieron con NheI (presente en el extremo 5') y KpnI (presente en la posición 292 en el gen HPR), y el fragmento de 290 pares de bases liberado de los mutantes se ligó con el fragmento del vector NheI-KpnI obtenido del mutante E111A. El mutante triple K7A/N71A/E111A se preparó mutando la Lys-7 a Ala mediante reacción en cadena de la polimerasa como se mencionó anteriormente, utilizando el mutante doble N71A/E111A como plantilla. El triple mutante Q11A/N71A/E111A se creó mediante mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótidos utilizando el doble mutante N71A/E111A como molde y cebador JKB 11. Para la construcción del mutante cuádruple K7A/Q11A/N71A/E111A , se utilizó el mutante triple Q11A/N71A/E111A como plantilla, y la mutación K7A se introdujo mediante reacción en cadena de la polimerasa. Todas las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN utilizando el método de terminación de cadena didesoxi (32Sanger F. Niklen S. Coulson A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977; 74: 5463-5467Crossref PubMed Scopus (52771) Google Scholar). La HPR se ha sobreexpresado anteriormente en E. coli y se ha purificado a partir de los cuerpos de inclusión para obtener una enzima funcionalmente activa (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Las proteínas mutantes de HPR se prepararon de manera similar a partir de los cultivos de la cepa de E. coli BL21(λDE3), se transformaron con el plásmido apropiado y se cultivaron en supercaldo que contenía 100 μg/ml de ampicilina (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Se encontró que todos los mutantes de HPR se acumulan en cuerpos de inclusión citoplasmáticos que se procesaron adicionalmente como se describe (33Buchner J. Pastan I. Brinkmann U. Anal. Biochem. 1992; 205: 263-270Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar). La solubilización del sedimento de cuerpos de inclusión se logró en 6 m de HCl de guanidio. La renaturalización de la proteína solubilizada se realizó diluyendo la proteína en un amortiguador de replegamiento que contenía l-arginina y glutatión oxidado. La proteína renaturalizada, después de la diálisis, se cargó en una columna de intercambio catiónico S-Sepharose. La proteína se eluyó con un gradiente de 0–1 m NaCl y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Los espectros CD de las proteínas purificadas se registraron usando una dicrografía Jasco J720 (Easton) en la región UV lejana (190–250 nm). Cada proteína, 33 μg/ml en fosfato de sodio 10 mm, pH 7.0, se utilizó en una célula con una trayectoria óptica de 1 cm para registrar los espectros. Los espectros se adquirieron a una velocidad de escaneo de 50 nm/min con una sensibilidad de 50 mdeg y un tiempo de respuesta de 1 s. Los espectros medidos fueron una media de 10 acumulaciones, y los resultados se presentan como valores medios de elipticidad residual. La actividad ribonucleolítica de varios mutantes se analizó en sustratos poli(C), poli(U), ARNt de levadura y poli(A·U) como se describe por Bond (34Bond M.D. Anal. Biochem. 1988; 173: 166-173Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Cada sustrato (40 μg) se incubó por separado con diferentes concentraciones de la HPR de tipo salvaje o sus mutantes en Tris-HCl 100 mm, pH 7,5, durante 1 h a 37 °C. El ARN de gran peso molecular no digerido se precipitó con ácido perclórico y acetato de uranilo en hielo y se retiró mediante centrifugación a 15.000 × g durante 10 min. El producto soluble en ácido se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. La actividad hidrolítica de HPR y sus mutantes en CMP cíclico se evaluó de acuerdo con el método de Crook et ál. (35Crook E.M. Mathias A.P. Rabin B.R. Biochem. J. 1960; 74: 234-238 Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar). En un amortiguador de reacción que consiste en 0.2 m Tris-HCl, pH 7.5 y 0.02 m EDTA, se mezcló 0.1 mg/ml de CMP cíclico con 40 μg/ml de la enzima, y la reacción se monitoreó espectrofotométricamente a 284 nm a 25 °C. La actividad de RNasa de varias proteínas en los sustratos de dinucleótidos CpA, UpA y UpG se midió utilizando el procedimiento de Witzel y Barnard (36Witzel H. Barnard E.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962; 7: 295-299Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). El sustrato apropiado, 50 μm en amortiguador Tris-HCl 100 mm, pH 7.0, se incubó con HPR o sus mutantes (concentración final 5 μm) a 25 °C. El cambio en la absorbancia a 284 nm se controló espectrofotométricamente. Los mutantes de HPR se analizaron para determinar la actividad ribonucleolítica en presencia de hRI mediante el uso de un ensayo basado en gel de agarosa (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). En resumen, en un volumen total de 10 μl, se mezclaron 10 ng de enzima con 4 μg de ARN de hígado de rata total y 20 unidades de hRI recombinante en Tris-HCl 100 mm, pH 7,5, que contenía ditiotreitol 10 mm. La mezcla se incubó durante 10 min a 37 °C; la reacción se detuvo mediante la adición de 2 μl de tampón de carga de gel que contenía Tris-HCl 10 mm, pH 7,5, EDTA 50 mm, glicerol (30% v/v), xileno cianol FF (0,25% p/v) y azul de bromofenol (0,25% p/v) y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio. La actividad de RNasa de los mutantes, en presencia de RI, se estudió cuantitativamente analizando su actividad en el sustrato de homopolímero de ARN más preferido, poli(C), en un ensayo descrito anteriormente (34Bond M.D. Anal. Biochem. 1988; 173: 166-173Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Las constantes de inhibición (K i ) para las interacciones mutantes RI-HPR se determinaron midiendo la velocidad de estado estacionario de la escisión de poli(C) en presencia de RI. Las reacciones se realizaron en Tris-HCl 100 mm, pH 7,5, que contenía enzima de 2,8 nm y 50–300 μm de poli(C). Se utilizaron concentraciones de IR en el rango de 300–700 pm, y los datos de velocidad inicial se utilizaron para preparar gráficos de Lineweaver-Burk, a partir de los cuales se calculó K i. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron en cinco líneas celulares diferentes: U373MG (glioblastoma humano), J774A.1 (monocito-macrófago de ratón), K562 (eritroleucemia humana), A431 (carcinoma epidermoide humano) y A549 (carcinoma de pulmón humano). La citotoxicidad se evaluó midiendo la incorporación de [3H]leucina en la proteína recién sintetizada. Las células se incubaron con RNasas durante 40 h, seguido de un pulso de 3 h con 0,75 μCi/pocillo de [3H]leucina. A continuación, las células se cosecharon en filtros de fibra de vidrio utilizando un cosechador de células. Los filtros se secaron y se realizaron recuentos utilizando un contador de centelleo líquido. Los valores de ID50 representan la concentración de la RNasa que inhibió la síntesis de proteínas celulares en un 50%. El objetivo del estudio fue investigar si la afinidad de HPR por RI podría reducirse mutando residuos de contacto específicos, presumiblemente involucrados en la unión de HPR a RI. Seleccionamos los residuos objetivo en HPR en función de dos criterios. En primer lugar, el residuo debe estar involucrado en la unión de HPR con RI formando un enlace de hidrógeno o un contacto de van der Waal con RI, según lo definido por la estructura cristalina del complejo RI·RNasa. En segundo lugar, el residuo objetivo no debe estar involucrado en el sitio activo de HPR. Sobre la base de estudios de homología con los residuos implicados en la unión a RI de varias RNasas, especialmente RNasa A, seleccionamos cuatro residuos diana en HPR: Lys-7, Gln-11, Asn-71 y Glu-111. Reemplazamos estos residuos en HPR con alanina para producir los mutantes K7A, Q11A, N71A y E111A. Se eligió la alanina porque elimina la cadena lateral más allá del carbono β sin alterar la conformación principal. Combinamos las mutaciones individuales para formar tres mutantes dobles, K7A/E111A, Q11A/E111A y N71A/E111A; dos mutantes triples, K7A/N71A/E111A y Q11A/N71A/E111A; y un mutante cuádruple, K7A/Q11A/N71A/E111A. En RNasa A, se ha demostrado que la mutación de Gly-88 a Arg disminuye su sensibilidad a la inactivación de RI y, en consecuencia, aumenta la potencia citotóxica en muchas veces (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Gly-88 en RNasa A es homóloga a Gly-89 en HPR. En el estudio actual mutamos individualmente Gly-89 y también Asn-88 y Ser-90 a Arg, produciendo tres mutantes individuales, N88R, G89R y S90R. Los mutantes se expresaron en E. coli, y las proteínas sobreexpresadas, aisladas de los cuerpos de inclusión, se purificaron hasta homogeneidad a través de un esquema de purificación de dos etapas compuesto por intercambio catiónico y cromatografía de filtración en gel. Los mutantes de HPR purificados migraron en electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida como bandas individuales correspondientes a sus pesos moleculares esperados (Fig.1 A). Un anticuerpo policlonal contra HPR reaccionó con las 13 proteínas mutantes igualmente bien como se muestra en las transferencias Western (Fig. 1 B). Los rendimientos finales típicos de las proteínas recombinantes purificadas estuvieron en el intervalo de 10–20 mg/litro de cultivo. La caracterización estructural se llevó a cabo mediante análisis espectral de CD para estudiar el efecto de las mutaciones en la conformación general de HPR. Como se muestra en la Fig. 2, la HPR recombinante parece estar plegada de forma compacta con una conformación α+β. Los espectros de CD de las proteínas mutantes K7A, Q11A, N71A y E111A (Fig. 2 A); K7A/E111A, Q11A/E111A y N71A/E111A (Fig. 2 B); K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A y K7A/Q11A/N71A/E111A (Fig. 2 C); y N88R y G89R (Fig.2 D) indicaron una modesta alteración; sin embargo, la estructura general parece ser similar a la de la proteína de tipo salvaje. La conformación de S90R (Fig. 2 D) se encontró que estaba alterada en comparación con la HPR de tipo salvaje, mostrando una disminución significativa en el contenido de hélice α del mutante. La actividad de RNasa de los siete mutantes de alanina individuales se analizó en tres sustratos de ARN diferentes: poli(C), ARNt de levadura y CMP cíclico. Las RNasas pancreáticas tienen preferencia por sustratos de ARN ricos en pirimidina. En el sustrato de homopolímero de pirimidina monocatenario, poli(C), los mutantes K7A, Q11A, N71A y E111A mostraron una actividad similar o superior en comparación con HPR de tipo salvaje (TablaII). En el ARNt de levadura, el mutante K7A mostró una actividad del 78% en comparación con la enzima de tipo salvaje, mientras que los mutantes Q11A, N71A y E111A mostraron una actividad aproximadamente 50% menor (Tabla II). La actividad hidrolítica de HPR y sus mutantes se estudió mediante el monitoreo espectrofotométrico de la descomposición del CMP cíclico en 3'-monofosfato. Se encontró que los mutantes K7A, Q11A, N71A y E111A poseen una actividad hidrolítica similar a la de la HPR de tipo salvaje (TablaII).Tabla IIActividad catalítica de los mutantes de HPRProteínaΔA/min/mg de proteínaPoli (C) ARNt de levaduraCMPCpApAUpGHPR227,000 (100)16,300 (100)0.37 (100) 0.1400.138NDK7A241,000 (106)12,800 (78)0.45 (121) 0.1480.130NDQ11A186,000 (82)7,950 (48)0.29 (78) 0.1300.020NDN71A313,000 (140)7,600 (46)0.67 (181) 0.1200.0500.280E111A508,000 (224)8,800 (53)0.54 (145) 0.1300.0770.070Substratos de poli(C), ARNt de levadura y cCMP se incubaron por separado con diferentes concentraciones de la HPR de tipo salvaje o sus mutantes durante 1 h a 37 °C. El ARN de gran peso molecular no digerido se precipitó con ácido perclórico y acetato de uranilo en hielo y se eliminó mediante centrifugación. El producto soluble en ácido se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. Cada sustrato de dinucleótido se incubó con HPR y sus mutantes a 25 °C. El cambio en la absorbancia a 284 nm se controló espectrofotométricamente. La actividad específica se ha expresado como ΔA/min/mg de proteína. El porcentaje de actividad en comparación con la actividad de HPR se muestra entre paréntesis. ND, no determinable. Tabla abierta en una nueva pestaña Los sustratos poli(C), ARNt de levadura y cCMP se incubaron por separado con diferentes concentraciones de la HPR de tipo salvaje o sus mutantes durante 1 h a 37 °C. El ARN de gran peso molecular no digerido se precipitó con ácido perclórico y acetato de uranilo en hielo y se eliminó mediante centrifugación. El producto soluble en ácido se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. Cada sustrato de dinucleótido se incubó con HPR y sus mutantes a 25 °C. El cambio en la absorbancia a 284 nm se controló espectrofotométricamente. La actividad específica se ha expresado como ΔA/min/mg de proteína. El porcentaje de actividad en comparación con la actividad de HPR se muestra entre paréntesis. ND, no determinable. Los mutantes K7A, Q11A, N71A y E111A mostraron una actividad similar a la enzima de tipo salvaje en el sustrato de dinucleótido CpA más favorecido (Tabla II). En UpA, el mutante K7A mostró una actividad similar a la de HPR, pero hubo una pérdida significativa en la actividad de los mutantes Q11A, N71A y E111A (Tabla II). En el sustrato de dinucleótido UpG, como HPR, también se encontró que los mutantes K7A y Q11A estaban inactivos, mientras que los mutantes N71A y E111A mostraron actividad de RNasa, siendo N71A más activo (Tabla II). En poli(C), en comparación con HPR, se encontró que el mutante N71A/E111A tenía una actividad 3 veces mayor (Tabla III). Se encontró que la actividad de los mutantes N88R, G89R, S90R, K7A/E111A y K7A/N71A/E111A era similar a la de la HPR de tipo salvaje en poli(C), mientras que los mutantes Q11A/E111A, Q11A/N71A/E111A y K7A/Q11A/N71A/E111A mostraron una actividad de RNasa muy pobre (Tabla III). La actividad catalítica II de la Tabla de los mutantes de HPR en poli(C) ProteínaΔA/min/mg de proteínaHPR227,000 (100)K7A/E111A292,000 (128) Q11A/E111A80,000 (35) N71A/E111A688,000 (303)K7A/N71A/E111A262,000 (115) Q711A/N71A/E111A48,000 (21)K7A/Q11A/N71A/E111A48,000 (21) N88R237,000 (104) G89R2,000 (97) S90R232,500 (102)El sustrato de poli(C) se incubó con diferentes concentraciones de la HPR de tipo salvaje y sus mutantes a 1 °C. El ARN de gran peso molecular no digerido se precipitó con ácido perclórico y acetato de uranilo en hielo y se eliminó mediante centrifugación. El producto soluble en ácido se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. La actividad específica se ha expresado como ΔA/min/mg de proteína. El porcentaje de actividad en comparación con la actividad de HPR se muestra entre paréntesis. Tabla abierta en una nueva pestaña El sustrato de poli(C) se incubó con diferentes concentraciones de la HPR de tipo salvaje y sus mutantes durante 1 h a 37 °C. El ARN de gran peso molecular no digerido se precipitó con ácido perclórico y acetato de uranilo en hielo y se eliminó mediante centrifugación. El producto soluble en ácido se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. La actividad específica se ha expresado como ΔA/min/mg de proteína. El porcentaje de actividad c

Mammalian ribonucleases interact very strongly with the intracellular ribonuclease inhibitor (RI). Eukaryotic cells exposed to mammalian ribonucleases are protected from their cytotoxic action by the intracellular inhibition of ribonucleases by RI. Human pancreatic ribonuclease (HPR) is structurally and functionally very similar to bovine RNase A and interacts with human RI with a high affinity. In the current study, we have investigated the involvement of Lys-7, Gln-11, Asn-71, Asn-88, Gly-89, Ser-90, and Glu-111 in HPR in its interaction with human ribonuclease inhibitor. These contact residues were mutated either individually or in combination to generate mutants K7A, Q11A, N71A, E111A, N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A, and K7A/Q11A/N71A/E111A. Out of these, eight mutants, K7A, Q11A, N71A, S90R, E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, and K7A/N71A/E111A, showed an ability to evade RI more than the wild type HPR, with the triple mutant K7A/N71A/E111A having the maximum RI resistance. As a result, these variants exhibited higher cytotoxic activity than wild type HPR. The mutation of Gly-89 in HPR produced no change in the sensitivity of HPR for RI, whereas it has been reported that mutating the equivalent residue Gly-88 in RNase A yielded a variant with increased RI resistance and cytotoxicity. Hence, despite its considerable homology with RNase A, HPR shows differences in its interaction with RI. We demonstrate that interaction between human pancreatic ribonuclease and RI can be disrupted by mutating residues that are involved in HPR-RI binding. The inhibitor-resistant cytotoxic HPR mutants should be useful in developing therapeutic molecules. Mammalian ribonucleases interact very strongly with the intracellular ribonuclease inhibitor (RI). Eukaryotic cells exposed to mammalian ribonucleases are protected from their cytotoxic action by the intracellular inhibition of ribonucleases by RI. Human pancreatic ribonuclease (HPR) is structurally and functionally very similar to bovine RNase A and interacts with human RI with a high affinity. In the current study, we have investigated the involvement of Lys-7, Gln-11, Asn-71, Asn-88, Gly-89, Ser-90, and Glu-111 in HPR in its interaction with human ribonuclease inhibitor. These contact residues were mutated either individually or in combination to generate mutants K7A, Q11A, N71A, E111A, N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A, and K7A/Q11A/N71A/E111A. Out of these, eight mutants, K7A, Q11A, N71A, S90R, E111A, Q11A/E111A, N71A/E111A, and K7A/N71A/E111A, showed an ability to evade RI more than the wild type HPR, with the triple mutant K7A/N71A/E111A having the maximum RI resistance. As a result, these variants exhibited higher cytotoxic activity than wild type HPR. The mutation of Gly-89 in HPR produced no change in the sensitivity of HPR for RI, whereas it has been reported that mutating the equivalent residue Gly-88 in RNase A yielded a variant with increased RI resistance and cytotoxicity. Hence, despite its considerable homology with RNase A, HPR shows differences in its interaction with RI. We demonstrate that interaction between human pancreatic ribonuclease and RI can be disrupted by mutating residues that are involved in HPR-RI binding. The inhibitor-resistant cytotoxic HPR mutants should be useful in developing therapeutic molecules. bovine seminal ribonuclease human pancreatic ribonuclease ribonuclease inhibitor human ribonuclease inhibitor Mammalian ribonucleases constitute a ubiquitous superfamily of proteins with a high level of structural and functional divergence. These include a group of homologous proteins isolated from many mammalian, avian, reptilian, and amphibian sources and are collectively known to be part of the RNase A superfamily (1Beintema J.J. Breukelman H.J. Carsana A. Furia A. D'Alessio G. Riordan J.F. Ribonucleases : Structures and Functions. Academic Press, New York1997: 245-269Crossref Google Scholar). The current resurgence of interest in RNases is the result of the discovery of RISBASES (RNases with Special Biological Actions), which have been identified to influence tumor cell growth, neurological development, and biological differentiation (2D'Alessio G. Trends Cell Biol. 1993; 3: 106-109Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). An important biological function of mammalian RNases may be host defense, as has been observed in the case of the two eosinophil RNases, eosinophil cationic protein and eosinophil-derived neurotoxin, which exhibit antiviral, antibacterial, antiparasitic, and neurotoxic activities (3Domachowske J.B. Rosenberg H.F. J. Leukocyte Biol. 1997; 62: 363-368Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar, 4Lehrer R.I. Szklarek D. Barton A. Ganz T. Hamann K.J. Gleich G. J. Immunol. 1989; 142: 4428-4434PubMed Google Scholar, 5Rosenberg H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7876-7881Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar, 6Durack D.T. Ackerman S.J. Loegering D.A. Gleich G.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981; 78: 5165-5169Crossref PubMed Scopus (185) Google Scholar, 7Newton D.L. Walbridge S. Mikulski S.M. Ardelt W. Shogen K. Ackerman S.J. Rybak S.M. Youle R.J. J. Neurosci. 1994; 14: 538-544Crossref PubMed Google Scholar). Also, frog RNase onconase and bovine seminal ribonuclease (BS-RNase)1 exhibit antitumor activity (8Nitta K. Ozaki K. Ishikawa M. Furusawa S. Hosono M. Kawauchi H. Sasaki K. Takayanagi Y. Tsuiki S. Hakomori S. Cancer Res. 1994; 54: 920-927PubMed Google Scholar, 9Mikulski S.M. Grossman A.M. Carter P.W. Shogen K. Costanzi J.J. Int. J. Oncol. 1993; 3: 57-64PubMed Google Scholar, 10Vescia S. Tramontano D. Augusti-Tocco G. D'Alessio G. Cancer Res. 1980; 40: 3740-3744PubMed Google Scholar, 11Laccetti P. Portella G. Mastronicola M.R. Russo A. Piccoli R. D'Alessio G. Vecchio G. Cancer Res. 1992; 52: 4582-4586PubMed Google Scholar). Human pancreatic ribonuclease (HPR) is secretory in nature and has been considered as a counterpart of bovine pancreatic RNase A (12Beintema J.J. Wietzes P. Weickmann J. Glitz J.J. Anal. Biochem. 1984; 136: 48-64Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 13Seno M. Futami J. Kosaka M. Seno S. Yamada H. Biochim. Biophys. Acta. 1994; 1218: 466-468Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar). Although HPR shares 70% homology with RNase A and possesses similar key structural and catalytic residues, it displays some unique features (14Weickmann J.L. Elson M. Glitz D.G. Biochemistry. 1981; 20: 1272-1278Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar). HPR possesses substantial activity against double-stranded RNA, contains a higher proportion of basic residues, its activity is differentially influenced by ionic strength and divalent ions, and compared with RNase A it has a carboxyl-terminal extension of four residues, EDST (15Bardon' A. Sierakowska H. Shugar D. Biochim. Biophys. Acta. 1976; 438: 461-473Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 16Sorrentino S. Libonati M. Arch. Biochem. Biophys. 1994; 312: 340-348Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar, 17Sorrentino S. Glitz D.G. Hamann K.J. Loegering D.A. Checkel J.L. Gleich G.J. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14859-14865Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). We have reported earlier that deletion of the carboxyl-terminal EDST extension enhances the RNase activity and thermostability of HPR (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Although both RNase A and HPR catalyze RNA degradation efficiently, they have not been associated with any special biological action, and hence their physiological role, especially that of HPR, is not clearly defined. RNases have much potential as chemotherapeutics. Onconase is presently undergoing phase III human clinical trials for the treatment of malignant mesothelemia (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K. J. Biol. Chem. 1991; 266: 245-251Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and has also been shown to inhibit human immunodeficiency virus type I replication in chronically infected human cells (20Saxena S.K. Gravell M. Wu Y.-N. Mikulski S.M. Shogen K. Ardelt W. Youle R.J. J. Biol. Chem. 1996; 271: 20783-20788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (79) Google Scholar). A majority of pancreatic RNases, with the exception of BS-RNase and onconase, are not cytotoxic. The major apparent reason for this poor cytotoxicity is the neutralization of the ribonucleolytic activity of RNases by the cytosolic RNase inhibitor (RI). Hence, affinity of a RNase for the intracellular RI could play an important role in defining its cytotoxic potency. HPR holds tremendous promise as a therapeutic agent for humans, and compared with other RNases it is likely to be less immunogenic and thus more efficacious. When the RI-sensitive "noncytotoxic" RNases are injected directly into Xenopusoocytes, which lack strong inhibitors to mammalian RNases, they display cytotoxic activity comparable to ricin and diphtheria toxin (21Saxena S.K. Rybak S.M. Winkler G. Meade H.M. McGray P. Youle R.J. Ackerman E.J. J. Biol. Chem. 1991; 266: 21208-21214Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Moreover, the two classes of RNases with anticancer activity, onconase and BS-RNase, are found to be resistant to cytosolic RI protein, and their cytotoxic activities appear to be a consequence of their abilities to escape inactivation by RI. (22Wu Y.N. Mikulski S.M. Ardelt W. Rybak S.M. Youle R.J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 10686-10693Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992; 281: 343-348Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). BS-RNase is a naturally occurring homodimer that is stabilized by two intersubunit disulfide bridges. The BS-RNase monomer is highly homologous to RNase A; however, the dimeric form has a much lower affinity for RI than the free monomer (23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992; 281: 343-348Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). Onconase evades RI as a monomer because of a lack of amino acid residues that are responsible for making contact with RI. Only three residues that contact RI in RNase A are conserved in onconase (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K. J. Biol. Chem. 1991; 266: 245-251Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Kobe B. Diesenhofer J. Nature. 1995; 374: 183-186Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar). RI is a 50-kDa protein that constitutes 0.01% of the total cytosolic protein and is a highly conserved protein in various mammalian species (25Lee F.S. Vallee B.L. Prog. Nucleic Acids Res. 1993; 44: 1-30Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 26Hofsteenge J. D'Alessio G. Riordan J.F. Ribonucleases : Structures and Functions. Academic Press, New York1997: 621-658Crossref Google Scholar). RI forms a 1:1 noncovalent complex with RNase A; and as seen from the three-dimensional structure of pRI·RNase A complex, one-third of the enzyme, including its active site, sits within the horseshoe-shaped structure of the inhibitor (27Kobe B. Diesenhofer J. J. Mol. Biol. 1996; 264: 1028-1043Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar). A similar interaction has been observed with angiogenin and human RI (hRI); however, the intermolecular contacts in the RI·RNase complex differ because of the differences in the sequences of the two RNases (28Papageorgiou A.C. Shapiro R. Acharya K.R. EMBO J. 1997; 16: 5162-5177Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar). Recently, the crystal structure of a variant of HPR, having five amino-terminal residues replaced by those in the BS-RNase, has been determined (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000; 303: 49-59Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). The structure of this HPR variant shares the overall size and characteristic V shape of the other RNases of its family; however, it differs significantly from RNase A in various loop regions (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000; 303: 49-59Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). It has been demonstrated recently that RNase A can be engineered as a cytotoxin by mutating the specific contact residue Gly-88, which led to a decrease in its susceptibility to RI inactivation (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Because the potency of a cytotoxic RNase can be defined in terms of its affinity for the RI, it is possible that HPR could be transformed into a cytotoxin by lowering its sensitivity to RI inactivation. In the current study we have investigated the role of four plausible contact residues in HPR in its interaction with the hRI with an aim to generate cytotoxic HPR variants. We have generated variants of HPR which have enhanced resistance toward inactivation by the hRI and are more cytotoxic. HPR is a protein consisting of 128 amino acid residues. pHPR, a plasmid containing the 384- base pair HPR gene, cloned downstream of a T7 promoter (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar), was used as template to mutate the target residues Lys-7, Gln-11, Asn-71, and Glu-111 to Ala. Similarly, the residues Asn-88, Gly-89, and Ser-90 were mutated to arginine. Except for K7A, all of the mutations were carried out by oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis (31Kunkel T.A. Roberts J.D. Zakour R.A. Methods Enzymol. 1987; 154: 367-382Crossref PubMed Scopus (4560) Google Scholar). Uracil containing DNA template was prepared by infecting CJ236 strain ofEscherichia coli with the recombinant phage and growing it in the presence of uridine and chloramphenicol (31Kunkel T.A. Roberts J.D. Zakour R.A. Methods Enzymol. 1987; 154: 367-382Crossref PubMed Scopus (4560) Google Scholar). Mutagenesis was performed using DNA primers JKB 8, JKB 9, JKB 10, JKB 11, JKB 15, JKB 16, and JKB 29 containing the mutations G89R, N88R, K7A, Q11A, N71A, E111A, and S90R, respectively. Sequences of various primers used are shown in Table I. Primer extension products were transformed into E. coli strain DH5α by standard methods. The mutant K7A was constructed by polymerase chain reaction using pHPR as the template, JKB 10 as the forward primer, and a universal EcoRI reverse primer. The primers were designed such that the amplified HPR fragment carrying the mutation K7A had recognition sites for NheI at the 5′-end andEcoRI at the 3′-end. The amplified fragment was digested with NheI and EcoRI, purified by gel electrophoresis, and cloned into a T7 promoter based-E. coliexpression vector pVEX11 restricted with the same enzymes. pVEX11 is a pUC-based vector that has a phage T7 promoter, multiple cloning sites, and a T7 transcription terminator.Table ISequence of primers used for mutagenesis of the putative residuesMutantPrimerSequenceK7AJKB 105′-ATGGCTAGCAAGGAATCCCGGGCCAAGgctTTCCAGCGG-3′Q11AJKB 115′-ACTGTCTGAGTCCATATGagcCCGCTGGAATTTCTTGGC-3′N71AJKB 155′-GGAGTTGCTCTTGTAGCAagcGCCCTGCCCGTTCTTGCA-3′E111AJKB 165′-TGGCACATATGGGCTCCCagcACAGGCCACAATGATGTG-3′N88RJKB 95′-GTTGGGGTACCTGGAGCCcctTGTCAGGCGGCAGTCTGT-3′G89RJKB 85′-ACAGTTGGGGTACCTGGAcctGTTTGTCAGGCGGCAGTC-3′S90RJKB 295′-TGCACAGTTGGGGTAcctACGGCCGTTTGTCAGGCGGCA-3′The underlined letters in lower case represent the nucleotides mutated. Open table in a new tab The underlined letters in lower case represent the nucleotides mutated. For constructing the double mutants K7A/E111A, Q11A/E111A, and N71A/E111A, mutants K7A, Q11A, N71A, and E111A were digested withNheI (present at the 5′-end) and KpnI (present at position 292 in the HPR gene), and the 290-base pair fragment released from the mutants was ligated with the NheI-KpnI vector fragment obtained from the E111A mutant. The triple mutant K7A/N71A/E111A was prepared by mutating the Lys-7 to Ala by polymerase chain reaction as mentioned above, using the double mutant N71A/E111A as the template. The triple mutant Q11A/N71A/E111A was created by oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis using the double mutant N71A/E111A as the template and primer JKB 11. For the construction of the quadruple mutant K7A/Q11A/N71A/ E111A, the triple mutant Q11A/N71A/E111A was used as the template, and the K7A mutation was introduced by polymerase chain reaction. All mutations were confirmed by DNA sequencing using the dideoxy chain termination method (32Sanger F. Niklen S. Coulson A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977; 74: 5463-5467Crossref PubMed Scopus (52771) Google Scholar). HPR has been overexpressed earlier in E. coli and purified from the inclusion bodies to obtain functionally active enzyme (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). The HPR mutant proteins were prepared similarly from the cultures of E. coli strain BL21(λDE3), transformed with appropriate plasmid, and grown in superbroth containing 100 μg/ml ampicillin (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). All HPR mutants were found to accumulate in cytoplasmic inclusion bodies that were processed further as described (33Buchner J. Pastan I. Brinkmann U. Anal. Biochem. 1992; 205: 263-270Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar). The solubilization of the inclusion body pellet was achieved in 6 m guanidium HCl. Renaturation of the solubilized protein was done by diluting the protein in a refolding buffer containing l-arginine and oxidized glutathione. The renatured protein, after dialysis, was loaded on an S-Sepharose cation exchange column. The protein was eluted with a gradient of 0–1 m NaCl and purified further by gel filtration chromatography (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 465-469Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). CD-spectra of purified proteins were recorded using a Jasco J720 (Easton) dichrograph in the far UV region (190–250 nm). Each protein, 33 μg/ml in 10 mm sodium phosphate, pH 7.0, was used in a cell with a 1-cm optical path to record the spectra. The spectra were acquired at a scan speed of 50 nm/min with a sensitivity of 50 mdeg and response time of 1 s. The spectra measured were an average of 10 accumulations, and the results are presented as mean residual ellipticity values. The ribonucleolytic activity of various mutants was assayed on substrates poly(C), poly(U), yeast tRNA, and poly(A·U) as described by Bond (34Bond M.D. Anal. Biochem. 1988; 173: 166-173Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Each substrate (40 μg) was incubated separately with different concentrations of the wild type HPR or its mutants in 100 mm Tris-HCl, pH 7.5, for 1 h at 37 °C. The undigested large molecular weight RNA was precipitated with perchloric acid and uranyl acetate on ice and removed by centrifugation at 15,000 × g for 10 min. The acid-soluble product was quantitated by measuring the absorbance at 260 nm. The hydrolytic activity of HPR and its mutants on cyclic CMP was assayed according to the method of Crook et al. (35Crook E.M. Mathias A.P. Rabin B.R. Biochem. J. 1960; 74: 234-238Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar). In a reaction buffer consisting of 0.2 m Tris-HCl, pH 7.5, and 0.02 m EDTA, 0.1 mg/ml cyclic CMP was mixed with 40 μg/ml of the enzyme, and the reaction was monitored spectrophotometrically at 284 nm at 25 °C. The RNase activity of various proteins on dinucleotide substrates CpA, UpA, and UpG was measured by using the procedure of Witzel and Barnard (36Witzel H. Barnard E.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962; 7: 295-299Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). The appropriate substrate, 50 μm in 100 mm Tris-HCl buffer, pH 7.0, was incubated with HPR or its mutants (final concentration 5 μm) at 25 °C. The change in absorbance at 284 nm was monitored spectrophotometrically. The HPR mutants were screened for ribonucleolytic activity in the presence of hRI by using an agarose gel-based assay (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Briefly, in a total volume of 10 μl, 10 ng of enzyme was mixed with 4 μg of total rat liver RNA and 20 units of recombinant hRI in 100 mm Tris-HCl, pH 7.5, containing10 mm dithiothreitol. The mixture was incubated for 10 min at 37 °C; the reaction was stopped by the addition of 2 μl of gel loading buffer containing 10 mm Tris-HCl, pH 7.5, 50 mm EDTA, glycerol (30% v/v), xylene cyanol FF (0.25% w/v), and bromphenol blue (0.25% w/v) and subjected to electrophoresis on a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide. The RNase activity of the mutants, in the presence of RI, was studied quantitatively by assaying their activity on the most preferred RNA homopolymer substrate, poly(C), in an assay described above (34Bond M.D. Anal. Biochem. 1988; 173: 166-173Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). The inhibition constants (K i ) for the RI-HPR mutant interactions were determined by measuring the steady-state rate of poly(C) cleavage in the presence of RI. Reactions were performed in 100 mm Tris-HCl, pH 7.5, containing 2.8 nm enzyme and 50–300 μm poly(C). RI concentrations in the range 300–700 pm were used, and the initial velocity data were used to prepare Lineweaver-Burk plots, from which K i was calculated. The cytotoxicity assays were performed on five different cell lines: U373MG (human glioblastoma), J774A.1 (mouse monocyte-macrophage), K562 (human erythroleukemia), A431 (human epidermoid carcinoma), and A549 (human lung carcinoma). Cytotoxicity was evaluated by measuring [3H]leucine incorporation into newly synthesized protein. Cells were incubated with RNases for 40 h, followed by a 3-h pulse with 0.75 μCi/well [3H]leucine. The cells were then harvested onto glass fiber filters using a cell harvester. The filters were dried, and counts were taken using a liquid scintillation counter. The ID50 values represent the concentration of the RNase which inhibited the cellular protein synthesis by 50%. The aim of the study was to investigate whether the affinity of HPR for RI could be reduced by mutating specific contact residues, presumably involved in the binding of HPR to RI. We selected target residues in HPR based on two criteria. First, the residue must be involved in binding of HPR with RI by either forming a hydrogen bond or van der Waal contact with RI, as defined by the crystal structure of the RI·RNase complex. Second, the target residue must not be involved in the active site of HPR. On the basis of homology studies with the residues involved in the RI binding of several RNases, especially RNase A, we selected four target residues in HPR: Lys-7, Gln-11, Asn-71, and Glu-111. We replaced these residues in HPR with alanine to yield mutants K7A, Q11A, N71A, and E111A. Alanine was chosen because it eliminates the side chain beyond the β-carbon without altering the main conformation. We combined the single mutations to form three double mutants, K7A/E111A, Q11A/E111A, and N71A/E111A; two triple mutants, K7A/N71A/E111A and Q11A/N71A/E111A; and a quadruplet mutant, K7A/Q11A/N71A/E111A. In RNase A mutation of Gly-88 to Arg has been shown to decrease its sensitivity to RI inactivation and consequently increase the cytotoxic potency by many fold (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 10407-10412Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Gly-88 in RNase A is homologous to Gly-89 in HPR. In the current study we individually mutated Gly-89 and also Asn-88 and Ser-90 to Arg, yielding three single mutants, N88R, G89R, and S90R. The mutants were expressed in E. coli, and the overexpressed proteins, isolated from the inclusion bodies, were purified to homogeneity through a two-step purification scheme comprised of cation exchange and gel filtration chromatography. The purified HPR mutants migrated on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis as single bands corresponding to their expected molecular weights (Fig.1 A). A polyclonal antibody against HPR reacted with all 13 mutant proteins equally well as shown by the Western blots (Fig. 1 B). Typical final yields of the purified recombinant proteins were in the range of 10–20 mg/liter of culture. Structural characterization was carried out by CD spectral analysis to study the effect of mutations on the overall conformation of HPR. As shown in Fig. 2, the recombinant HPR appears to be folded compactly with an α+β conformation. The CD spectra of the mutant proteins K7A, Q11A, N71A, and E111A (Fig. 2 A); K7A/E111A, Q11A/E111A, and N71A/E111A (Fig. 2 B); K7A/N71A/E111A, Q11A/N71A/E111A, and K7A/Q11A/N71A/E111A (Fig. 2 C); and N88R and G89R (Fig.2 D) indicated a modest alteration; however, the overall structure appears to be similar to that of the wild type protein. The conformation of S90R (Fig. 2 D) was found to be altered compared with the wild type HPR, showing a significant decrease in the α-helical content of the mutant. The RNase activity of the seven single alanine mutants was assayed on three different RNA substrates: poly(C), yeast tRNA, and cyclic CMP. Pancreatic RNases have a preference for pyrimidine-rich RNA substrates. On the single-stranded, pyrimidine homopolymer substrate, poly(C), the mutants K7A, Q11A, N71A, and E111A displayed a similar or higher activity compared with wild type HPR (TableII). On yeast tRNA, the mutant K7A showed 78% activity compared with the wild type enzyme, whereas the mutants Q11A, N71A, and E111A displayed about 50% lower activity (Table II). The hydrolytic activity of HPR and its mutants was studied by spectrophotometrically monitoring the breakdown of the cyclic CMP to 3′-monophosphate. The mutants K7A, Q11A, N71A, and E111A were found to possess hydrolytic activity similar to that of the wild type HPR (TableII).Table IICatalytic activity of HPR mutantsProteinΔA/min/mg proteinPoly(C)Yeast tRNAcCMPCpAUpAUpGHPR227,000 (100)16,300 (100)0.37 (100)0.1400.138NDK7A241,000 (106)12,800 (78)0.45 (121)0.1480.130NDQ11A186,000 (82)7,950 (48)0.29 (78)0.1300.020NDN71A313,000 (140)7,600 (46)0.67 (181)0.1200.0500.280E111A508,000 (224)8,800 (53)0.54 (145)0.1300.0770.070Substrates poly(C), yeast tRNA, and cCMP were incubated separately with different concentrations of the wild type HPR or its mutants for 1 h at 37 °C. The undigested large molecular weight RNA was precipitated with perchloric acid and uranyl acetate on ice and removed by centrifugation. The acid-soluble product was quantitated by measuring the absorbance at 260 nm. Each dinucleotide substrate was incubated with HPR and its mutants at 25 °C. The change in absorbance at 284 nm was monitored spectrophotometrically. The specific activity has been expressed as ΔA/min/mg protein. The percent activity compared with the HPR activity is shown in parentheses. ND, not determinable. Open table in a new tab Substrates poly(C), yeast tRNA, and cCMP were incubated separately with different concentrations of the wild type HPR or its mutants for 1 h at 37 °C. The undigested large molecular weight RNA was precipitated with perchloric acid and uranyl acetate on ice and removed by centrifugation. The acid-soluble product was quantitated by measuring the absorbance at 260 nm. Each dinucleotide substrate was incubated with HPR and its mutants at 25 °C. The change in absorbance at 284 nm was monitored spectrophotometrically. The specific activity has been expressed as ΔA/min/mg protein. The percent activity compared with the HPR activity is shown in parentheses. ND, not determinable. The mutants K7A, Q11A, N71A, and E111A exhibited activity similar to the wild type enzyme on the most favored dinucleotide substrate CpA (Table II). On UpA, the mutant K7A showed activity similar to that of HPR, but there was a significant loss in activity of the mutants Q11A, N71A, and E111A (Table II). On the dinucleotide substrate UpG, like HPR, mutants K7A and Q11A also were found to be inactive, whereas mutants N71A and E111A displayed RNase activity, with N71A being more active (Table II). On poly(C), compared with HPR the mutant N71A/E111A was found to have a 3-fold higher activity (Table III). The activity of the mutants N88R, G89R, S90R, K7A/E111A, and K7A/N71A/E111A was found to be similar to that of the wild type HPR on poly(C), whereas the mutants Q11A/E111A, Q11A/N71A/E111A, and K7A/Q11A/N71A/E111A displayed very poor RNase activity (Table III).Table IIICatalytic activity of the HPR mutants on poly(C)ProteinΔA/min/mg proteinHPR227,000 (100)K7A/E111A292,000 (128)Q11A/E111A80,000 (35)N71A/E111A688,000 (303)K7A/N71A/E111A262,000 (115)Q11A/N71A/E111A48,000 (21)K7A/Q11A/N71A/E111A48,000 (21)N88R237,000 (104)G89R220,000 (97)S90R232,500 (102)The poly(C) substrate was incubated with different concentrations of the wild type HPR and its mutants for 1 h at 37 °C. The undigested large molecular weight RNA was precipitated with perchloric acid and uranyl acetate on ice and removed by centrifugation. The acid-soluble product was quantitated by measuring the absorbance at 260 nm. The specific activity has been expressed as ΔA/min/mg protein. The percent activity compared with the HPR activity is shown in parentheses. Open table in a new tab The poly(C) substrate was incubated with different concentrations of the wild type HPR and its mutants for 1 h at 37 °C. The undigested large molecular weight RNA was precipitated with perchloric acid and uranyl acetate on ice and removed by centrifugation. The acid-soluble product was quantitated by measuring the absorbance at 260 nm. The specific activity has been expressed as ΔA/min/mg protein. The percent activity c

تتفاعل الريبونوكليزات الثديية بقوة مع مثبط الريبونوكليز داخل الخلايا. الخلايا حقيقية النواة المعرضة للريبونوكليزات الثديية محمية من تأثيرها السام للخلايا عن طريق تثبيط الريبونوكليزات داخل الخلايا بواسطة RI. يتشابه الريبونوكلياز البنكرياسي البشري (HPR) هيكليًا ووظيفيًا جدًا مع الريبونوكلياز أ البقري ويتفاعل مع الريبونوكلياز البشري ذو التقارب العالي. في الدراسة الحالية، قمنا بالتحقيق في تورط Lys -7 و Gln -11 و Asn -71 و Asn -88 و Gly -89 و Ser -90 و Glu -111 في HPR في تفاعلها مع مثبط الريبونوكلياز البشري. تم تحور بقايا التلامس هذه إما بشكل فردي أو مجتمعة لتوليد الطفرات K7A و Q11A و N71A و E111A و N88R و G89R و S90R و K7A/E111A و Q11A/E111A و N71A/E111A و K7A/N71A/E111A و Q11A/N71A/E111A و K7A/Q11A/N71A/E111A. من بين هذه، أظهرت ثمانية مسوخ، K7A، Q11A، N71A، S90R، E111A، Q11A/E111A، N71A/E111A، و K7A/N71A/E111A، قدرة على التهرب من RI أكثر من النوع البري HPR، مع وجود الطفرة الثلاثية K7A/N71A/E111A التي تتمتع بأقصى مقاومة RI. ونتيجة لذلك، أظهرت هذه المتغيرات نشاطًا سامًا للخلايا أعلى من النوع البري HPR. لم ينتج عن طفرة Gly -89 في مصل الدم البشري أي تغيير في حساسية مصل الدم البشري لـ RI، في حين تم الإبلاغ عن أن طفرة البقايا المكافئة Gly -88 في RNase A أسفرت عن متغير مع زيادة مقاومة RI والسمية الخلوية. وبالتالي، على الرغم من تماثله الكبير مع RNase A، يُظهر مجلس نواب الشعب اختلافات في تفاعله مع RI. نوضح أن التفاعل بين ريبونوكلياز البنكرياس البشري وRI يمكن أن يتعطل عن طريق تحور المخلفات التي تشارك في ربط HPR - RI. يجب أن تكون الطفرات السامة للخلايا المقاومة للمثبطات مفيدة في تطوير الجزيئات العلاجية. تتفاعل الريبونوكليزات الثديية بقوة مع مثبط الريبونوكليز داخل الخلايا. الخلايا حقيقية النواة المعرضة للريبونوكليزات الثديية محمية من تأثيرها السام للخلايا عن طريق تثبيط الريبونوكليزات داخل الخلايا بواسطة RI. يتشابه الريبونوكلياز البنكرياسي البشري (HPR) هيكليًا ووظيفيًا جدًا مع الريبونوكلياز أ البقري ويتفاعل مع الريبونوكلياز البشري ذو التقارب العالي. في الدراسة الحالية، قمنا بالتحقيق في تورط Lys -7 و Gln -11 و Asn -71 و Asn -88 و Gly -89 و Ser -90 و Glu -111 في HPR في تفاعلها مع مثبط الريبونوكلياز البشري. تم تحور بقايا التلامس هذه إما بشكل فردي أو مجتمعة لتوليد الطفرات K7A و Q11A و N71A و E111A و N88R و G89R و S90R و K7A/E111A و Q11A/E111A و N71A/E111A و K7A/N71A/E111A و Q11A/N71A/E111A و K7A/Q11A/N71A/E111A. من بين هذه، أظهرت ثمانية مسوخ، K7A، Q11A، N71A، S90R، E111A، Q11A/E111A، N71A/E111A، و K7A/N71A/E111A، قدرة على التهرب من RI أكثر من النوع البري HPR، مع وجود الطفرة الثلاثية K7A/N71A/E111A التي تتمتع بأقصى مقاومة RI. ونتيجة لذلك، أظهرت هذه المتغيرات نشاطًا سامًا للخلايا أعلى من النوع البري HPR. لم ينتج عن طفرة Gly -89 في مصل الدم البشري أي تغيير في حساسية مصل الدم البشري لـ RI، في حين تم الإبلاغ عن أن طفرة البقايا المكافئة Gly -88 في RNase A أسفرت عن متغير مع زيادة مقاومة RI والسمية الخلوية. وبالتالي، على الرغم من تماثله الكبير مع RNase A، يُظهر مجلس نواب الشعب اختلافات في تفاعله مع RI. نوضح أن التفاعل بين ريبونوكلياز البنكرياس البشري وRI يمكن أن يتعطل عن طريق تحور المخلفات التي تشارك في ربط HPR - RI. يجب أن تكون طفرات الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز المقاومة للخلايا مفيدة في تطوير الجزيئات العلاجية. الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الريبونوكلياز الثدييات تشكل عائلة عظمى في كل مكان من البروتينات مع مستوى عال من الاختلاف الهيكلي والوظيفي. وتشمل هذه مجموعة من البروتينات المتماثلة المعزولة عن العديد من مصادر الثدييات والطيور والزواحف والبرمائيات والمعروفة مجتمعة بأنها جزء من عائلة RNase A (1Beintema JJ Breukelman H.J. Carsana A. Furia A. D'Alicio G. Riordan JF Ribonucleases : الهياكل والوظائف. مطبعة أكاديمية، نيويورك 1997: 245-269 كروسريف الباحث العلمي من Google). إن عودة الاهتمام الحالية بـ RNases هي نتيجة لاكتشاف RISBASES (RNases مع إجراءات بيولوجية خاصة)، والتي تم تحديدها للتأثير على نمو الخلايا السرطانية، والتطور العصبي، والتمايز البيولوجي (2D 'ALISIO G. Trends Cell Biol. 1993 ؛ 3: 106-109 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (97) الباحث العلمي من Google). قد تكون الوظيفة البيولوجية المهمة لـ RNases الثدييات هي دفاع المضيف، كما لوحظ في حالة RNases اليوزينية، والبروتين الكاتيوني اليوزيني والسموم العصبية المشتقة من اليوزينية، والتي تظهر أنشطة مضادة للفيروسات ومضادة للبكتيريا ومضادة للطفيليات وسمية عصبية (3Domachowske J.B. Rosenberg HF J. Leukocyte Biol. 1997 ؛ 62: 363-368 Crossref PubMed Scopus (30) باحث جوجل، 4Lehrer RI Szklarek D. Barton A. Ganz T. Hamann KJ Gleich GJ Immunol. 1989 ؛ 142: 4428-4434 PubMed باحث جوجل، 5Rosenberg H.F.J. Biol. Chem. 1995 ؛ 270: 7876-7881 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar، 6Durack D.T. Ackerman S.J. Loegering D.A. Gleich G.J. Proc. ناتل. أكاد. خيال علمي. الولايات المتحدة الأمريكية 1981 ؛ 78: 5165-5169 Crossref PubMed Scopus (185) باحث جوجل، 7Newton D.L. Walbridge S. Mikulski S.M. Ardelt W. Shogen K. Ackerman S.J. Rybak S.M. Youle R.J. Neurosci. 1994 ؛ 14: 538-544 Crossref PubMed Google Scholar). أيضًا، يُظهر الضفدع RNase onconase والريبونوكلياز المنوي البقري (BS - RNase)1 نشاطًا مضادًا للورم (8Nitta K. Ozaki K. Ishikawa M. Furusawa S. Hosono M. Kawauchi H. Sasaki K. Takayanagi Y. Tsuiki S. Hakomori S. Cancer Res. 1994 ؛ 54: 920-927 PubMed Google Scholar، 9Mikulski S.M. Grossman AM. Carter P.W. Shogen K. Costanzi JJ Int. J. Oncol. 1993 ؛ 3: 57-64 PubMed Google Scholar، 10Vescia S. Tramontano D. Augusti - Tocco G. D'Alicio G. Cancer Res. 1980 ؛ 40: 3740-3744 PubMed Google Scholar، 11Laccetti P. Portella G. Mastronicola M.R. Russo A. Piccoli R. D'Alessio G. Vecchio G. Cancer Res. 1992 ؛ 52: 4582-4586 PubMed Google Scholar). إن ريبونوكلياز البنكرياس البشري (HPR) إفرازي بطبيعته وقد تم اعتباره نظيرًا لـ RNase A البنكرياسي البقري (12Beintema JJ Wietzes P. Weickmann J. Glitz JJ Anal. Biochem. 1984 ؛ 136: 48-64 Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar، 13Seno M. Futami J. Kosaka M. Seno S. Yamada H. Biochim. البيوفيزياء. اكتا. 1994 ؛ 1218: 466-468 Crossref PubMed Scopus (23) باحث جوجل). على الرغم من أن مجلس نواب الشعب يشترك في 70 ٪ من التماثل مع RNase A ويمتلك بقايا هيكلية وحفازة رئيسية مماثلة، إلا أنه يعرض بعض الميزات الفريدة (14Weickmann J.L. Elson M. Glitz D.G. Biochemistry. 1981 ؛ 20: 1272-1278 Crossref PubMed Scopus (71) الباحث العلمي من Google). يمتلك HPR نشاطًا كبيرًا ضد الحمض النووي الريبي المزدوج، ويحتوي على نسبة أعلى من المخلفات الأساسية، ويتأثر نشاطه بشكل تفاضلي بالقوة الأيونية والأيونات ثنائية التكافؤ، وبالمقارنة مع RNase A، فإنه يحتوي على امتداد طرفي كربوكسيل لأربعة مخلفات، EDST (15Bardon ' A. Sierakowska H. Shugar D. Biochim. بيوفيس. اكتا. 1976 ؛ 438: 461-473 كروسريف بوبمد سكوبس (33) باحث جوجل، 16 سورينتينو س. ليبوناتي م. آرتش. الكيمياء الحيوية. البيوفيزياء الحيوية. 1994 ؛ 312: 340-348 Crossref PubMed Scopus (87) باحث جوجل، 17Sorrentino S. Glitz D.G. Hamann K.J. Loegering D.A. Checkel JL Gleich G.J. Biol. CHEM. 1992 ؛ 267: 14859-14865 ملخص النص الكامل PDF PubMed Google Scholar). لقد أبلغنا سابقًا أن حذف تمديد EDST لمحطة الكربوكسيل يعزز نشاط RNase وقابلية الحرارة لـ HPR (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ؛ 245: 465-469 Crossref PubMed Scopus (19) الباحث العلمي من Google). على الرغم من أن كل من RNase A و HPR يحفزان تدهور الحمض النووي الريبي بكفاءة، إلا أنهما لم يرتبطان بأي عمل بيولوجي خاص، وبالتالي فإن دورهما الفسيولوجي، وخاصة دور HPR، غير محدد بوضوح. تتمتع RNases بإمكانات كبيرة كعلاج كيميائي. يخضع أونكوناسي حاليًا للمرحلة الثالثة من التجارب السريرية البشرية لعلاج ميزوثيليميا الخبيثة (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen K.J. Biol. CHEM. 1991 ؛ 266: 245-251 ملخص النص الكامل PDF PubMed Google Scholar) وقد ثبت أيضًا أنه يمنع تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية من النوع الأول في الخلايا البشرية المصابة بشكل مزمن (20 Saxena S.K. Gravell M. Wu Y. N. Mikulski S.M. Shogen K. Ardelt W. Youle R.J. J. Biol. CHEM. 1996 ؛ 271: 20783-20788 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (79) Google Scholar). غالبية RNases البنكرياس، باستثناء BS - RNase و onconase، ليست سامة للخلايا. السبب الرئيسي الظاهر لهذه السمية الخلوية السيئة هو تحييد النشاط الريبونيوكليوتي لأنزيمات RNase بواسطة مثبط RNase الخلوي (RI). وبالتالي، فإن تقارب RNase مع RI داخل الخلايا يمكن أن يلعب دورًا مهمًا في تحديد فعاليته السامة للخلايا. يحمل رد الفعل البشري وعدًا هائلاً كعامل علاجي للبشر، وبالمقارنة مع RNases الأخرى، فمن المرجح أن يكون أقل مناعة وبالتالي أكثر فعالية. عندما يتم حقن RNases "غير السامة للخلايا" الحساسة لـ RI مباشرة في Xenopusoocytes، والتي تفتقر إلى مثبطات قوية لـ RNases الثدييات، فإنها تعرض نشاطًا سامًا للخلايا مشابهًا للريسين وسموم الخناق (21Saxena S.K. Rybak S.M. Winkler G. Meade H.M. McGray P. Youle R.J. Ackerman E.J. J. Biol. CHEM. 1991 ؛ 266: 21208-21214 ملخص النص الكامل PDF PubMed Google Scholar). علاوة على ذلك، وجد أن فئتي RNases ذات النشاط المضاد للسرطان، onconase و BS - RNase، مقاومة لبروتين RI الخلوي، ويبدو أن أنشطتها السامة للخلايا هي نتيجة لقدرتها على الهروب من التعطيل بواسطة RI. (22Wu Y.N. Mikulski S.M. Ardelt W. Rybak S.M. Youle R.J. J. Biol. الكيمياء. 1993 ؛ 268: 10686-10693 ملخص النص الكامل PDF PubMed Google Scholar، 23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992 ؛ 281: 343-348 Crossref PubMed Scopus (64) الباحث العلمي من Google). BS - RNase هو ثنائي متجانس يحدث بشكل طبيعي ويتم تثبيته بواسطة جسرين ثنائيي الكبريتيد بين الوحدات الفرعية. مونومر BS - RNase متماثل للغاية مع RNase A ؛ ومع ذلك، فإن الشكل الثنائي له تقارب أقل بكثير مع RI من المونومر الحر (23Murthy B.S. Sirdeshmukh R. Biochem. J. 1992 ؛ 281: 343-348 Crossref PubMed Scopus (64) الباحث العلمي من Google). يتهرب Onconase من RI كمونومر بسبب نقص بقايا الأحماض الأمينية المسؤولة عن الاتصال بـ RI. يتم حفظ ثلاثة بقايا فقط تلامس RI في RNase A في onconase (19Ardelt W. Mikulski S.M. Shogen KJ Biol. CHEM. 1991 ؛ 266: 245-251 ملخص النص الكامل PDF PubMed Google Scholar، 24Kobe B. Diesenhofer J. Nature. 1995 ؛ 374: 183-186 Crossref PubMed Scopus (578) الباحث العلمي من Google). RI هو بروتين 50 كيلو دالتون يشكل 0.01 ٪ من إجمالي بروتين السيتوسوليك وهو بروتين محفوظ للغاية في مختلف أنواع الثدييات (25Lee F.S. Vallee B.L. Prog. الأحماض النووية Res. 1993 ؛ 44: 1-30 Crossref PubMed Scopus (91) باحث جوجل، 26Hofsteenge J. D'Alicio G. Riordan JF Ribonucleases: الهياكل والوظائف. مطبعة أكاديمية، نيويورك 1997: 621-658 كروسريف الباحث العلمي من Google). يشكل RI مركبًا غير متكافئ 1:1 مع RNase A ؛ وكما يتضح من البنية ثلاثية الأبعاد لمركب PRI•RNase A، فإن ثلث الإنزيم، بما في ذلك موقعه النشط، يقع داخل البنية على شكل حدوة حصان للمثبط (27Kobe B. Diesenhofer JJ Mol. Biol. 1996 ؛ 264: 1028-1043 Crossref PubMed Scopus (177) الباحث العلمي من Google). لوحظ تفاعل مماثل مع أنجيوجينين وRI البشري (HRI )؛ ومع ذلك، تختلف الاتصالات بين الجزيئات في مركب RI•RNase بسبب الاختلافات في تسلسل RNases (28Papageorgiou A.C. Shapiro R. Acharya K.R. EMBO J. 1997 ؛ 16: 5162-5177 Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar). في الآونة الأخيرة، تم تحديد البنية البلورية لمتغير من مجلس نواب الشعب، الذي يحتوي على خمس بقايا أمينية مستبدلة بتلك الموجودة في BS - RNase (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000 ؛ 303: 49-59 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). يشترك هيكل هذا المتغير في الحجم الكلي والشكل المميز V لأنواع RNase الأخرى في عائلته ؛ ومع ذلك، فإنه يختلف اختلافًا كبيرًا عن RNase A في مناطق الحلقة المختلفة (29Pous J. Canals A. Terzyan S.S. Guasch A. Benito A. Ribo M. Vilanova M. Coll M. J. Mol. Biol. 2000 ؛ 303: 49-59 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). لقد ثبت مؤخرًا أن RNase A يمكن هندسته كسم خلوي عن طريق تحوير بقايا التلامس المحددة Gly -88، مما أدى إلى انخفاض في قابليته لتعطيل RI (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 ؛ 95: 10407-10412 Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). نظرًا لأنه يمكن تحديد فاعلية RNase السامة للخلايا من حيث تقاربها مع RI، فمن الممكن أن يتحول HPR إلى سم خلوي عن طريق تقليل حساسيته لتعطيل RI. في الدراسة الحالية، قمنا بالتحقيق في دور أربع بقايا تلامس معقولة في مفاعل هرمونات البوتاسيوم في تفاعله مع مفاعل هرمونات البوتاسيوم بهدف توليد متغيرات مفاعل هرمونات البوتاسيوم السامة للخلايا. لقد أنشأنا متغيرات من مجلس نواب الشعب التي عززت المقاومة تجاه التعطيل من قبل مبادرة الموارد البشرية وهي أكثر سمية للخلايا. HPR هو بروتين يتكون من 128 من بقايا الأحماض الأمينية. pHPR، وهو بلازميد يحتوي على جين HPR المكون من 384 زوجًا أساسيًا، مستنسخ في اتجاه مجرى مروج T7 (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. تم استخدام J. Biochem. 1997 ؛ 245: 465-469 Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar)، كقالب لتحويل المخلفات المستهدفة Lys -7 و Gln -11 و Asn -71 و Glu -111 إلى ALA. وبالمثل، تم تحور بقايا Asn -88 و Gly -89 و Ser -90 إلى أرجينين. باستثناء K7A، تم تنفيذ جميع الطفرات بواسطة الطفرات الموجهة بالموقع بوساطة الأوليجو نوكليوتيد (31 Kunkel TA Roberts JD Zakour RA Methods Enzymol. 1987 ؛ 154: 367-382 Crossref PubMed Scopus (4560) الباحث العلمي من Google). تم تحضير قالب الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل عن طريق إصابة سلالة CJ236 من الإشريكية القولونية بالعاثية المؤتلفة وزراعتها في وجود اليوريدين والكلورامفينيكول (31 Kunkel TA Roberts JD Zakour RA Methods Enzymol. 1987 ؛ 154: 367-382 Crossref PubMed Scopus (4560) الباحث العلمي من Google). تم إجراء الطفرات باستخدام بادئات الحمض النووي JKB 8 و JKB 9 و JKB 10 و JKB 11 و JKB 15 و JKB 16 و JKB 29 التي تحتوي على الطفرات G89R و N88R و K7A و Q11A و N71A و E111A و S90R، على التوالي. يتم عرض تسلسل مختلف الاشعال المستخدمة في الجدول الأول. تم تحويل منتجات التمديد التمهيدي إلى سلالة الإشريكية القولونية DH5α بالطرق القياسية. تم بناء الطفرة K7A بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام pHPR كقالب، JKB 10 كطبقة تمهيدية أمامية، وطبقة تمهيدية عكسية EcoRI عالمية. تم تصميم الاشعال بحيث يكون لشظية HPR المضخمة التي تحمل الطفرة K7A مواقع للتعرف على NHEI في الطرف الخامس و EcoRI في الطرف الثالث. تم هضم الشظية المضخمة باستخدام NHEI و EcoRI، وتم تنقيتها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي، واستنساخها إلى مروج T7 قائم على E. ناقل التعبير عن القولون pVEX11 مقيد بنفس الإنزيمات. pVEX11 هو ناقل قائم على pUC يحتوي على معزز phage T7، ومواقع استنساخ متعددة، ومنهي نسخ T7. الجدول ISequence من البرايمرات المستخدمة في توليد الطفرات من البقايا المفترضةMutantPrimerSequenceK7AJKB 105′ - ATGGCTAGCAAGGAATGGCCAAGGctTTCCAGCGGG -3 ′ Q11AJKB 115 ′- ACTGTCTGAGTCCATATGACTGACTGGGGATTGATTTCGATTTCGTCGTCGTGTCGGG 3 ′ N71AJKB 155 ′ - GGGGCTGCTGCTGATCGATCACCACCGACCGCCGGTGGTGGGTGGGGGGGGTGGGGGTGGGGGGGTGGGGGGGGGGGGTGGGGGGGGGGGGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG افتح الطاولة في علامة تبويب جديدة تمثل الأحرف المسطرة في الأحرف الصغيرة النيوكليوتيدات المتحورة. لبناء الطفرات المزدوجة K7A/E111A و Q11A/E111A و N71A/E111A، تم هضم الطفرات K7A و Q11A و N71A و E111A باستخدام NheI (الموجود في الطرف 5) و KpnI (الموجود في الموضع 292 في جين HPR)، وتم ربط جزء الزوج القاعدي 290 المنطلق من الطفرات بشظية ناقل NheI - KpnI التي تم الحصول عليها من متحولة E111A. تم تحضير الطفرة الثلاثية K7A/N71A/E111A عن طريق تحوير Lys -7 إلى ALA عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل كما هو مذكور أعلاه، باستخدام الطفرة المزدوجة N71A/E111A كقالب. تم إنشاء الطفرة الثلاثية Q11A/N71A/E111A بواسطة الطفرات الموجهة نحو الموقع بوساطة الأوليجو نوكليوتيد باستخدام الطفرة المزدوجة N71A/E111A كقالب وتمهيدي JKB 11. لبناء الطفرة الرباعية K7A/Q11A/N71A/E111A ، تم استخدام الطفرة الثلاثية Q11A/N71A/E111A كقالب، وتم إدخال طفرة K7A بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل. تم تأكيد جميع الطفرات عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام طريقة إنهاء سلسلة ديودوكسي (32Sanger F. Niklen S. Coulson A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977 ؛ 74: 5463-5467 Crossref PubMed Scopus (52771) Google Scholar). تم التعبير عن ارتفاع ضغط الدم في وقت سابق في الإشريكية القولونية وتنقيته من أجسام الإدراج للحصول على إنزيم نشط وظيفيًا (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ؛ 245: 465-469 Crossref PubMed Scopus (19) الباحث العلمي من Google). تم تحضير البروتينات الطافرة لـ HPR بشكل مشابه من مزارع سلالة الإشريكية القولونية BL21 (λDE3)، وتحولت إلى بلازميد مناسب، ونمت في شحم خارق يحتوي على 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلين (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ؛ 245: 465-469 Crossref PubMed Scopus (19) الباحث العلمي من Google). تم العثور على جميع طفرات مجلس نواب الشعب تتراكم في أجسام تضمين السيتوبلازم التي تمت معالجتها بشكل أكبر كما هو موضح (33Buchner J. Pastan I. Brinkmann U. Anal. Biochem. 1992 ؛ 205: 263-270 Crossref PubMed Scopus (364) الباحث العلمي من Google). تم تحقيق ذوبان كرية جسم التضمين في غوانيديوم حمض الهيدروكلوريك 6 م. تمت إعادة تشبع البروتين المذاب عن طريق تخفيف البروتين في مخزن مؤقت لإعادة الطي يحتوي على ل- أرجينين والجلوتاثيون المؤكسد. تم تحميل البروتين المعاد تشكيله، بعد غسيل الكلى، على عمود تبادل الكاتيون S - Sepharose. تم إزالة البروتين بتدرج من 0–1 م كلوريد الصوديوم وتنقيته بشكل أكبر بواسطة كروماتوغرافيا ترشيح الهلام (18Bal H.P. Batra J.K. Eur. J. Biochem. 1997 ؛ 245: 465-469 Crossref PubMed Scopus (19) الباحث العلمي من Google). تم تسجيل أطياف CD من البروتينات النقية باستخدام جاسكو J720 (إيستون) ديتشروغراف في منطقة الأشعة فوق البنفسجية البعيدة (190–250 نانومتر). تم استخدام كل بروتين، 33 ميكروغرام/مل في فوسفات الصوديوم 10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.0، في خلية ذات مسار بصري 1 سم لتسجيل الأطياف. تم الحصول على الأطياف بسرعة مسح 50 نانومتر/دقيقة مع حساسية 50 مللي ديغ ووقت استجابة 1 ثانية. كانت الأطياف المقاسة في المتوسط 10 تراكمات، ويتم عرض النتائج كقيم إهليلجية متبقية. تم اختبار النشاط الريبونوكليوتيك لمختلف الطفرات على ركائز بولي(C)، بولي(U)، خميرة الحمض النووي الريبي، وبولي(A·U) كما هو موضح من قبل بوند (34 بوند دكتوراه في الطب الشرجي. الكيمياء الحيوية. 1988 ؛ 173: 166-173 Crossref PubMed Scopus (49) عالم جوجل). تم تحضين كل ركيزة (40 ميكروغرام) بشكل منفصل بتركيزات مختلفة من النوع البري HPR أو طفراته في 100 مم Tris - HCl، الرقم الهيدروجيني 7.5، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تم ترسيب الحمض النووي الريبي ذو الوزن الجزيئي الكبير غير المهضوم مع حمض البيركلوريك وأسيتات اليورانيل على الجليد وإزالته عن طريق الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 10 دقائق. تم قياس المنتج القابل للذوبان في الحمض عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر. تم اختبار النشاط المائي لـ HPR وطفراته على CMP الدوري وفقًا لطريقة Crook et al. (35Crook E.M. Mathias A.P. Rabin B.R. Biochem. J. 1960 ؛ 74: 234-238 Crossref PubMed Scopus (355) الباحث العلمي من Google). في المخزن المؤقت للتفاعل الذي يتكون من 0.2 م ثلاثي هيدروكلوريد، ودرجة الحموضة 7.5، و 0.02 م EDTA، تم خلط 0.1 مجم/مل من CMP الحلقي مع 40 ميكروغرام/مل من الإنزيم، وتمت مراقبة التفاعل طيفيًا عند 284 نانومتر عند 25 درجة مئوية. تم قياس نشاط RNase لمختلف البروتينات على ركائز ثنائي النوكليوتيد CpA و UpA و UpG باستخدام إجراء Witzel و Barnard (36Witzel H. Barnard EA Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962 ؛ 7: 295-299 Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). تم تحضين الركيزة المناسبة، 50 ميكرومتر في 100 مم من المخزن المؤقت ثلاثي الهيدروكلور، الرقم الهيدروجيني 7.0، باستخدام HPR أو طفراته (التركيز النهائي 5 ميكرومتر) عند 25 درجة مئوية. تمت مراقبة التغير في الامتصاص عند 284 نانومتر بقياس الطيف الضوئي. تم فحص طفرات مجلس نواب الشعب بحثًا عن نشاط حال للنواة الريبوزية في وجود HRI باستخدام مقايسة قائمة على جل الأغاروز (30Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines r.t Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 ؛ 95: 10407-10412 Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). باختصار، في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر، تم خلط 10 نانوغرام من الإنزيم مع 4 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكبد الفئران و 20 وحدة من الحمض النووي الريبي المأشوب في 100 مم من ثلاثي هيدروكلوريد، الرقم الهيدروجيني 7.5، يحتوي على 10 مم من ديثيوثريتول. تم تحضين الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ؛ تم إيقاف التفاعل عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الهلام الذي يحتوي على 10 مم من ثلاثي الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، و 50 مم من EDTA، والجلسرين (30 ٪ فولت/فولت)، وزيلين سيانول FF (0.25 ٪ وزن/فولت)، وأزرق برومفينول (0.25 ٪ وزن/فولت) وإخضاعه للترحيل الكهربائي على هلام أغاروز بنسبة 1.5 ٪ يحتوي على بروميد الإيثيديوم. تمت دراسة نشاط RNase للطفرات، في وجود RI، كمياً من خلال فحص نشاطها على ركيزة الحمض النووي الريبي الأكثر تفضيلاً، بولي(C)، في الفحص الموصوف أعلاه (34Bond M.D. Anal. الكيمياء الحيوية. 1988 ؛ 173: 166-173 Crossref PubMed Scopus (49) عالم جوجل). تم تحديد ثوابت التثبيط (K i ) للتفاعلات الطافرة RI - HPR من خلال قياس معدل الحالة الثابتة لانقسام بولي(C) في وجود RI. تم إجراء التفاعلات في 100 مم Tris - HCl، الرقم الهيدروجيني 7.5، تحتوي على إنزيم 2.8 نانومتر و 50–300 ميكرومتر بولي(C). تم استخدام تركيزات RI في النطاق 300–700 مساءً، وتم استخدام بيانات السرعة الأولية لإعداد مخططات Lineweaver - Burk، والتي تم حساب Ki منها. تم إجراء فحوصات السمية الخلوية على خمسة خطوط خلايا مختلفة: U373MG (ورم أرومي دبقي بشري)، J774A.1 (بلعم وحيدات الفئران)، K562 (ابيضاض الدم الأحمر البشري)، A431 (سرطان بشري بشري بشري)، و A549 (سرطان الرئة البشري). تم تقييم السمية الخلوية عن طريق قياس [3H] دمج الليوسين في البروتين المصنع حديثًا. تم تحضين الخلايا باستخدام RNases لمدة 40 ساعة، تليها نبضة 3 ساعات مع 0.75 ميكرو سي/بئر [3H]لوسين. ثم تم حصاد الخلايا على مرشحات الألياف الزجاجية باستخدام حصادة الخلايا. تم تجفيف المرشحات، وتم أخذ العد باستخدام عداد وميض سائل. تمثل قيم ID50 تركيز RNase الذي يثبط تخليق البروتين الخلوي بنسبة 50 ٪. كان الهدف من الدراسة هو التحقيق فيما إذا كان من الممكن تقليل تقارب مجلس حقوق الإنسان مع منظمة الإغاثة الدولية عن طريق تحوير بقايا تلامس محددة، يُفترض أنها تشارك في ربط مجلس حقوق الإنسان بمنظمة الإغاثة الدولية. لقد اخترنا المخلفات المستهدفة في مجلس نواب الشعب بناءً على معيارين. أولاً، يجب أن تشارك البقايا في ربط الإنعاش القلبي الرئوي مع الإنعاش القلبي الرئوي إما عن طريق تكوين رابطة هيدروجينية أو تلامس فان دير وال مع الإنعاش القلبي الرئوي، كما هو محدد في البنية البلورية لمركب الإنعاش القلبي الرئوي. ثانيًا، يجب ألا تكون البقايا المستهدفة متورطة في الموقع النشط لمجلس نواب الشعب. على أساس دراسات التماثل مع البقايا المشاركة في ربط RI للعديد من RNases، وخاصة RNase A، اخترنا أربعة بقايا مستهدفة في HPR: Lys -7 و Gln -11 و Asn -71 و Glu -111. استبدلنا هذه البقايا في مصل الدم البشري بالألانين لإنتاج الطفرات K7A و Q11A و N71A و E111A. تم اختيار الألانين لأنه يزيل السلسلة الجانبية وراء β - carbon دون تغيير التشكل الرئيسي. قمنا بدمج الطفرات المفردة لتشكيل ثلاثة طفرات مزدوجة، K7A/E111A، Q11A/E111A، و N71A/E111A ؛ واثنين من الطفرات الثلاثية، K7A/N71A/E111A و Q11A/N71A/E111A ؛ وطفرة رباعية، K7A/Q11A/N71A/E111A. في RNase، ثبت أن طفرة Gly -88 إلى ARG تقلل من حساسيتها لتثبيط RI وبالتالي تزيد من الفاعلية السامة للخلايا بعدة أضعاف (30 Leland P.A. Wayne Schultz L. Kim B.M. Raines R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 ؛ 95: 10407-10412 Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar). Gly -88 في RNase A مماثل لـ Gly -89 في HPR. في الدراسة الحالية، قمنا بتحوير Gly -89 بشكل فردي وأيضًا Asn -88 و Ser -90 إلى Arg، مما أدى إلى ثلاثة طفرات مفردة، N88R و G89R و S90R. تم التعبير عن الطفرات في الإشريكية القولونية، وتم تنقية البروتينات المفرطة، المعزولة عن أجسام التضمين، إلى التجانس من خلال مخطط تنقية من خطوتين يتألف من تبادل الكاتيون واستشراب ترشيح الهلام. هاجرت طفرات HPR المنقّاة على الرحلان الكهربائي لهلام SDS - polyacrylamide كنطاقات مفردة تتوافق مع أوزانها الجزيئية المتوقعة (الشكل 1 أ). تفاعل الجسم المضاد متعدد النسائل ضد مصل الدم البشري مع جميع البروتينات الطافرة الـ 13 بالتساوي كما هو موضح في البقع الغربية (الشكل 1 ب). كانت الغلة النهائية النموذجية للبروتينات المؤتلفة النقية في حدود 10–20 ملغ/لتر من المزرعة. تم إجراء التوصيف الهيكلي من خلال التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة تأثير الطفرات على التشكل العام لمقاومة الضغط العالي. كما هو موضح في الشكل 2، يبدو أن مجلس نواب الشعب المؤتلف مطوي بشكل مضغوط مع شكل α+β. أطياف القرص المضغوط للبروتينات الطافرة K7A و Q11A و N71A و E111A (الشكل 2 أ )؛ K7A/E111A، Q11A/E111A، و N71A/E111A (الشكل 2 ب )؛ K7A/N71A/E111A، Q11A/N71A/E111A، و K7A/Q11A/N71A/E111A (الشكل 2 ج )؛ و N88R و G89R (الشكل 2 د) إلى تغيير متواضع ؛ ومع ذلك، يبدو أن الهيكل العام مشابه للبروتين من النوع البري. شكل S90R (الشكل 2 د) تم تغييره مقارنة بالنوع البري من رد الفعل البشري، مما يدل على انخفاض كبير في المحتوى الحلزوني ألفا للطفرة. تم اختبار نشاط RNASE لطفرات الألانين السبعة المفردة على ثلاث ركائز مختلفة من الحمض النووي الريبي: بولي(ج)، والحمض النووي الريبي الخميرة، و CMP الدوري. تفضل أنزيمات RNases البنكرياسية ركائز الحمض النووي الريبي الغنية بالبيريميدين. على ركيزة البوليمر المتجانس البيريميدين أحادي الجديلة، بولي(ج)، أظهرت الطفرات K7A و Q11A و N71A و E111A نشاطًا مشابهًا أو أعلى مقارنةً بالنوع البري HPR (الجدول II). على الحمض النووي الريبي للخميرة، أظهرت طفرة K7A نشاطًا بنسبة 78 ٪ مقارنة بإنزيم النوع البري، في حين أظهرت الطفرات Q11A و N71A و E111A نشاطًا أقل بنسبة 50 ٪ تقريبًا (الجدول الثاني). تمت دراسة النشاط المائي لـ HPR وطفراته من خلال الرصد الضوئي الطيفي لانهيار CMP الدوري إلى 3'-مونوفوسفات. تم العثور على أن المسوخات K7A و Q11A و N71A و E111A تمتلك نشاطًا تحليليًا مائيًا مشابهًا لنشاط النوع البري HPR (الجدول الثاني). الجدول II النشاط التحفيزي لمسوخات HPRProteinΔA/min/mg proteinPoly (C)الخميرة tRNAcCMPCpAUpAUpGHPR227,000 (100) 16,300 (100) 0.37 (100) 0.1400.138NDK7A241,000 (106) 12,800 (78) 0.45 (121) 0.1480.130NDQ11A186,000 (82) 7,950 (48) 0.29 (78) 0.1300.020NDN71A313,000 (140) 7,600 (46) 0.67 (181) 0.1200.0500.280E111A508,000 (224) 8,800 (53) 0.54 (145) 0.1300.077070Substrates (YE)، تم تحضينها بشكل منفصل مع تركيزات مختلفة من نوع HP عند 1 درجة مئوية. تم ترسيب الحمض النووي الريبي ذو الوزن الجزيئي الكبير غير المهضوم مع حمض البيركلوريك وأسيتات اليورانيل على الجليد وإزالته عن طريق الطرد المركزي. تم قياس المنتج القابل للذوبان في الحمض عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر. تم تحضين كل ركيزة ثنائية النوكليوتيد مع مجلس نواب الشعب وطفراته عند 25 درجة مئوية. تمت مراقبة التغير في الامتصاص عند 284 نانومتر بقياس الطيف الضوئي. تم التعبير عن النشاط المحدد على أنه ΔA/min/mg بروتين. يتم عرض النسبة المئوية للنشاط مقارنة بنشاط مجلس نواب الشعب بين قوسين. ND، غير قابل للتحديد. تم تحضين الطاولة المفتوحة في علامة تبويب جديدة الركائز بولي(C)، خميرة الحمض النووي الريبي، و cCMP بشكل منفصل بتركيزات مختلفة من النوع البري HPR أو طفراته لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم ترسيب الحمض النووي الريبي ذو الوزن الجزيئي الكبير غير المهضوم مع حمض البيركلوريك وأسيتات اليورانيل على الجليد وإزالته عن طريق الطرد المركزي. تم قياس المنتج القابل للذوبان في الحمض عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر. تم تحضين كل ركيزة ثنائية النوكليوتيد مع مجلس نواب الشعب وطفراته عند 25 درجة مئوية. تمت مراقبة التغير في الامتصاص عند 284 نانومتر بقياس الطيف الضوئي. تم التعبير عن النشاط المحدد على أنه ΔA/min/mg بروتين. يتم عرض النسبة المئوية للنشاط مقارنة بنشاط مجلس نواب الشعب بين قوسين. ND، غير قابل للتحديد. أظهرت الطفرات K7A و Q11A و N71A و E111A نشاطًا مشابهًا لإنزيم النوع البري على ركيزة ثنائي النوكليوتيد الأكثر تفضيلاً CpA (الجدول الثاني). على UpA، أظهرت طفرة K7A نشاطًا مشابهًا لنشاط HPR، ولكن كان هناك خسارة كبيرة في نشاط الطفرات Q11A و N71A و E111A (الجدول الثاني). على ركيزة ثنائي النوكليوتيد UpG، مثل HPR، وُجد أيضًا أن الطفرات K7A و Q11A غير نشطة، في حين أظهرت الطفرات N71A و E111A نشاط RNase، مع كون N71A أكثر نشاطًا (الجدول الثاني). على بولي(ج)، بالمقارنة مع مجلس نواب الشعب، وجد أن الطفرة N71A/E111A لها نشاط أعلى بثلاثة أضعاف (الجدول الثالث). تم العثور على نشاط المسوخات N88R و G89R و S90R و K7A/E111A و K7A/N71A/E111A مشابهًا لنشاط مسوخات HPR من النوع البري على poly(C)، في حين أن المسوخات Q11A/E111A و Q11A/N71A/E111A و K7A/Q11A/N71A/E111A أظهرت نشاط RNase ضعيفًا للغاية (الجدول الثالث). كان النشاط التحفيزي الثاني لمسوخات HPR على poly(C) ProteinΔA/min/mg proteinHPR227,000 (100) K7A/E111A292,000 (128) Q11A/E111A80,000 (35) N71A/E111A688,000 (303) K7A/N71A262,000 (115) Q111A/N71A/E111A11487A/N118887A (21) N111A/N118887A (21) N118887A/N117887R (21) N1170007A/E111A/E111A80,000 (35) N71A/E111A/E112202R (975002). تم ترسيب الحمض النووي الريبي ذو الوزن الجزيئي الكبير غير المهضوم مع حمض البيركلوريك وأسيتات اليورانيل على الجليد وإزالته عن طريق الطرد المركزي. تم قياس المنتج القابل للذوبان في الحمض عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر. تم التعبير عن النشاط المحدد على أنه ΔA/min/mg بروتين. يتم عرض النسبة المئوية للنشاط مقارنة بنشاط مجلس نواب الشعب بين قوسين. فتح الجدول في علامة تبويب جديدة تم تحضين الركيزة بولي(ج) بتركيزات مختلفة من النوع البري هبر وطفراته لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم ترسيب الحمض النووي الريبي ذو الوزن الجزيئي الكبير غير المهضوم مع حمض البيركلوريك وأسيتات اليورانيل على الجليد وإزالته عن طريق الطرد المركزي. تم قياس المنتج القابل للذوبان في الحمض عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر. تم التعبير عن النشاط المحدد على أنه ΔA/min/mg بروتين. النسبة المئوية للنشاط ج