Die weltweit verbreitete Blattrollkrankheit bei Weinreben wird unter anderem durch das Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1) verursacht. Infizierte Stöcke zeigen eine verringerte Wüchsigkeit und Qualität sowie einen geringeren Ertrag. Zu den Symptomen der Blattrollkrankheit zählen das Einrollen der Blätter nach unten und verfärbte Interkostalfelder, bei manchen Rebsorten sind diese Symptome aber kaum ausgeprägt. Neben der Rodung besteht die einzig wirksame Maßnahme darin, dass infizierte Reben von der Vermehrung ausgeschlossen werden. Dafür werden schnelle und sensitive Methoden benötigt. In dieser Arbeit wurde ein zuverlässiges Protokoll, bestehend aus einer RNA-Extraktion und der reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification method (RT-LAMP), für die Detektion von GLRaV-1 in Weinreben entwickelt. Bei der RT-LAMP handelt es sich um eine primerbasierte Methode, mit der Virusnukleinsäuren bei einer konstanten Temperatur amplifiziert und mittels Fluoreszenz in Echtzeit detektiert werden. Mithilfe der Methode ist eine zuverlässige, wiederholbare und spezifische Detektion von GLRaV-1 in Blatt- und Holzproben von verschiedenen Rebsorten möglich. Für die Detektion kann ein Tubescanner oder PCR-System verwendet werden. Die Proben sollten möglichst frisch getestet und nicht eingefroren werden. Die Empfindlichkeit wurde untersucht, indem gepoolte Proben und Verdünnungen von infizierten Proben in gesunden Pflanzen verwendet wurden. Während die Detektion der gepoolten Proben nicht in allen Replikaten erfolgreich war, konnte GLRaV-1 bis zu einer Verdünnung von 1:10 erfolgreich nachgewiesen werden. Demnach ist die Detektion mittels RT-LAMP schneller und sensitiver als mit dem DAS-ELISA. Verglichen mit der RT-PCR ist sie zwar weniger sensitiv, aber schneller. Neben den Möglichkeiten der Methode konnten auch die Grenzen wie das hohe Risiko für Kontaminationen und die zeitaufwändige RNA-Extraktion aufgezeigt werden.

Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1) is one of the causing agents of leafroll disease infesting vines worldwide. Infected grapevines show a reduction in vigor, yield and quality of the fruit. Leafroll is characterized by symptoms such as downward rolling of leaves and interveinal reddening, which are often subtle in certain grape varieties. Except for rouging, the only effective way to reduce the spread of the disease is excluding infected grapevines from propagation. This is why rapid and sensitive detection methods are needed. In this thesis a reliable protocol for the detection of GLRaV-1 in grapevines using RNA extraction and a reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification method (RT-LAMP) was developed. The RT-LAMP is a primer-based method amplifying viral nucleic acids at a constant temperature and detecting it with fluorescence in real time. With this method a reliable, repeatable and specific detection of GLRaV-1 in leaves and wood samples of different grape varieties is possible. For the detection both a tube scanner or a PCR system can be used. Sampled plant material should be tested fresh rather than freezing it before testing. The sensitivity was tested by pooling samples as well as diluting extracts from virus infected plants in healthy ones. While the detection of pooled samples was not feasible in all samples, the detection of GLRaV-1 with RT-LAMP was possible for all replicates diluted up to 1:10. Consequently, the detection through RT-LAMP is faster and more sensitive than DAS-ELISA. Compared to RT-PCR it is not as sensitive but quicker. Besides the possibilities given with this method, some limits concerning the high risk of contamination and the time consuming RNA extraction could be revealed.

Masterarbeit Universität für Bodenkultur Wien 2021

Masterarbeit Hochschule Geisenheim University 2021

Mit englischer Zusammenfassung

Isabell Spieß