Biyofilm, yüzeye bağlı mikroorganizmalar tarafından oluşturulan, EkstraselülerPolimer Matriks (EPS) ile çevrelenmiş bir yapıdır. Endüstriyel ve biyomedikaluygulamalarda kontrolsüz ve istenmeyen bölgelerde oluşan biyofilme bağlı hücreagregatları bu uygulamalarda ciddi ekonomik sorunlara neden olmaktadır.Endüstriyel sistemlerde biyofilm oluşumuna, dental yüzeyler, gıda endüstrisindekiüretim bandındaki kontaminasyonlar ve havalandırma sistemleri gibi birbirinden çokfarklı sistemlerde sıklıkla karşılaşılmaktadır. Biyofilm oluşumunun insan sağlığı ileilgili alanlarda yapılan çalışmalar genel olarak su sistemleri, dişçilik, protez veimplantlar üzerine yoğunlaşmaktadır. Biyofilm kaynaklı insan sağlığı problemleri,içme suyu kalitesindeki düşüş ve enerji üretim verimliliği gibi birçok konudabiyofilm oluşumunun verdiği hasarların maliyeti milyar dolarları bulmaktadır.Biyofilm oluşumuna bağlı genel sorunlar toplumlarda ciddi sağlık riski teşkiletmektedir. Hastane ortamına bağlı enfeksiyonlar, mide bağırsak enfeksiyonları,kulak, göz hastalıkları, biyofilme bağlı enfeksiyon risklerinin başında gelmektedir.Hem insan ve toplum sağlığı hem de ekonomik açıdan yaratmış olduğu zararlıetkileri nedeniyle, yüzey üzerinde mikrobiyal birikimi engelleyebilecek veya enazından büyümesini ve yayılmasını durdurabilecek yöntemlerin geliştirilmesineyönelik çalışmalar son yıllarda yoğun olarak yürütülmektedir.Doğada biyofilmi oluşturan mikroorganizmalar, salgıladıkları ekstrasellüler polimermatriks ile sarılıdırlar ve bu matriks, çevresel koşullardaki değişimlere karşı biyofilmyapısı içindeki mikroorganizmaları koruyucu bir katman görevi üstlenmektedir. Aynızamanda bu katman toksik kimyasalların ve antibiyotiklerin geçişini engelleyerekbiyofilm yapısındaki mikroorganizmalara koruyucu bir katman görevi görür. Hücrekatmanları arasında bulunan kanallar, biyofilmin gelişmesinde hayati öneme sahiptir.Mikroorganizmalar ihtiyaç duydukları besinlere ve oksijene bu kanallar sayesindeerişirken, atıkların ve ikincil metabolitlerin uzaklaştırılması da yine kanallar ilegerçekleşir. Ayrıca mikroorganizmaların iletişim amaçlı kullandığı sinyalmoleküllerinin iletimi bu kanallar üzerinden gerçekleşir.Enfeksiyon riskine karşı biyomedikal alanda biyosidal etkiye sahip antibiyotiklerinuzun süreli kullanımı, zaman içinde patojen mikroorganizmaların bu kimyasallarakarşı direnç kazanmasına ve antibiyotiklerin biyofilm oluşumunu engellemedeetkisiz kalmasına neden olmaktadır. Biyofilm oluşumunda mikroorganizmalararasında iletişimi sağlamak amacıyla Açil Homoserin Lakton (AHL), sinyalmolekülü olarak kullanılmaktadır. Bu molekül, biyofilmi oluşturanmikroorganizmalarca sentezlenerek hücre dışına salınmaktadır.AHL, diğermikroorganizmaların hücre duvarında bulunan sinyal reseptörlerince algılanır veantibiyotik direnç genleri, virülans faktörleri gibi çeşitli genetik elementlerinxxivekspresyonunu aktive eder. Bu iletişim sistemi literatürde `Quorum sensing` olarakadlandırılmaktadır. İletişim yolağının bloke edilmesine ise `Quorum quenching` adıverilmektedir ve mikroorganizmaların enfeksiyon ve koloni oluşumununengellenmesinde hayati öneme sahiptir. Bu çalışmada antibiyotiklerin etkimekanizmasından farklı olarak AHL sinyal yolizinin bloke edilerek,mikroorganizmaların yüzey üzerinde koloni oluşumunun engellenmesihedeflenmiştir. Sinyal yolizinin ve biyofilm oluşumunun engellenmesi maksadıyla,AHL molekülünün analogları olan halojenlenmiş furanonlar kullanılmıştır. AHLanalogları 5-(dibromomethylene)-3-methylfuran-2(5H)-one (FU1 olarakisimlendirildi), 3-(bromomethyl)-5-(dibromomethylene) furan-2(5H)-one (FU2olarak isimlendirildi), (Z-)-4-Bromo-5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone (4Z olarakisimlendirildi), 5-(Bromomethylene)-2(5H)-furanone (2(5H) olarak isimlendirildi)halojenlenmiş furanonlar solüsyon içinde, herhangi bir yüzeye kovalent veya nonkovalent bağ ile bağlı olmadan yapılan çalışmalarda biyofilm oluşumunuengellemede etkin olduklarını göstermişlerdir. Bu çalışmada yüzeye kovalent olarakbağlanan moleküllerin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkisi incelenmiştir. Aynızamanda yüzeye kovalent bağlı furanonun varlığında antibiyotiklerin biyofilmoluşumunu engellemedeki etkileri de incelenmiştir.Bu çalışmanın amacı, mikroorganizmaların endüstriyel ve özellikle tıbbi alanlardasıkça kullanılan yüzeylerde biyofilm oluşumunun engellenmesi için furanon türevleriile kaplı yüzeyler geliştirmektir. Medikal cihaz ve implant yüzeyleri mikrobiyalkontaminasyona ve buna bağlı enfeksiyon oluşum riski barındırmaktadırlar. Biyofilmengellemesine yönelik bugüne kadar yapılan çalışmalar da dikkate alınarak, yüzeyüzerindeki oluşumu engellemek üzere, biyofilm oluşumunda büyük öneme sahip`quorum sensing` sinyal yolizini bloke ettiği bilinen halojenlenmiş furanonlarınfarklı türevleri yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. Solüsyon içinde çözünmüş haldefuranon türevlerinin patojen mikroorganizmaların biyofilm oluşumunu engellediğidaha önce yapılan çalışmalarda kanıtlanmıştır. Bu çalışmada halojenlenmiş furanontürevlerinin kaplama malzemesi olarak kullanımının, Pseudomonas aeruginosa'nınyüzeye bağlanması üzerine etkisi incelenecektir. Pseudomonas aeruginosa fırsatçıpatojeni biyofilm oluşturduğu bilinen ve biyofilm çalışmalarında model olarakkullanılan gram-negatif bir mikroorganizmadır. Geliştirilen yüzeyin, kateter, implantgibi medikal yüzeylerde ve endüstriyel sistemlerde uygulanarak uzun ömürlü korumasağlanması hedeflenmektedir.Furanon moleküllerinin yüzeye bağlanmasında sol-jel yöntemi kullanılmıştır. SolJel'in serbest hidroksit grubuna karbodiimid reaksiyonu ile poliakrilik asitbağlanmıştır. Azid-nitren reaksiyonu ile yüzey üzerinde furanonun bağlanabileceğiserbest nitren grupları oluşturulmuştur. Nitren gruplarına furanon, UV ışık altındafotokimyasal yöntemler kullanılarak bağlanmıştır. Yüzey kimyasında değişim,moleküllerin yüzeye bağlanışı ve yüzey morfolojisi AFM, FTIR ve SEM ile analizedilmiştir.Bu çalışmada furanon molekülleri başarılı bir şekilde yüzeye kovalent olarakbağlanmıştır. AFM ve SEM çalışmaları ile kaplama çalışmalarındaki her aşamadamorfolojik değişim görüntülenmiştir. FTIR çalışmaları ile elde edilen bulgular AFMve SEM ile elde edilen görüntüleri doğrular niteliktedir. Yüzeye PAAbağlanmasından sonra yüzey pürüzlülüğü 2,059 ± 0,05nm'den 6,821 ± 0,5nmdeğerine çıkmıştır. Yüzey pürüzlülüğündeki değişim CFU sayımlarını daetkilemiştir.CFU sayımları ve CSLM görüntülemeleri FU1 ve FU2'nin biyofilm oluşumunuengellemedeki etkinliğini doğrular niteliktedir. FU2 molekülünün, FU1'e göre dahaetkin olduğu gözlemlenmiştir. AZA bağlı yüzeyle karşılaştırıldığında FU2 bakteriyelbağlanmayı % 76 oranında azaltırken FU1 bağlanmayı % 60 oranında azaltmıştır. 4-Z and 2-5(H) bağlı yüzeylerin biofilm oluşumunu engellemeye yönelik bir etkinliğiolmadığı tespit edilmiştir. FU2'nin toplam bakteriyel yükü AZA örneğinden 4 katSS-SC örneğinden 5 kat daha az olduğu tespit edilmiştir.Tobramisin furanon türevleri ile birlikte kullanıldığında yüzeye bağlı bakterimiktarını tobramisin kullanılmayan örneklerle (FU2 için % 78,9 oranında, FU1 için%65.4 oranında) karşılaştırıldığında FU2 için % 96,7 oranında FU1 için %79,4oranında azalttığı tespit edilmiştir.Furanon bağlı yüzeyler yabancı cisim enfeksiyon modeli kullanılarak in vivo testedilmiştir. Deney farelerinin % 68'inin 24. saatten önce öldüğü ve furanon kaplıyüzeyler CFU sayımının kontrol yüzeylere göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir.eDNA konsantrasyonu ve CFU sayımı arasındaki ilişkiye de bu çalışma ilebakılmıştır ve eDNA miktarının CFU sayımı ile orantılı olarak değiştiği saptanmıştır.Bu proje ITU-Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü ve İtalya'daki Chimica delRiconoscimento Molecolare, CNR, araştırma grubunun işbirliği ilegerçekleştirilmiştir. İtalya'da görevli grup yüzey kaplamalarının ve biofilmörneklerinin ATR-FTIR görüntülenmesinde görev almıştır. Çelik yüzey üzerinekovalent bağlama çalışmaları CNR grubu tarafından yapılmıştır. Arçelik A.Ş.araştırmacılara burs sağlayarak kısmi olarak katkıda bulunmuştur. CSLM deneylerive hayvanlarla gerçekleştirilen deneyler Kopenhag Üniversitesi Danimarka'dagerçekleştirilmiştir.

A biofilm is essentially composed of microbial cells attached to a surface andcompletely covered with an extracellular polymeric matrix (EPS) produced bybiofilm-forming bacteria. Uncontrollable and undesirable accumulation of cellaggregates constitute serious problems in industrial processes and biomedicalapplications. Studies concerning biofilm effects on human health are generallyperformed on water/systems (dentistry systems), prosthesis and implants. Biofilmformation and metabolic activities within may cause serious community health risks.Most of these health risks are nosocomial infections of gastrointestinal, eye and earetc.Because of these reasons, there is a growing demand for developing strategies toremove and protect the surfaces against biofilm formation .The benefits of biofilm formation to microorganism include increased protectionagainst antimicrobials and defence mechanisms. A biofilm cannot be considered as ahomogeneous distribution of cells but it can be thought as a cluster of cells enclosedwithin a matrix with channels and pores. These channels facilitate the transport ofoxygen and nutrients to the biofilm forming units. Removal of waste products andsecondary metabolites also occur through these channels.Medical devices and implants are highly susceptible to microbial contamination andinfection of biomedical devices is a considerable and increasing problem. The aim ofour study is to prevent these infections from the application of a thin coating thatprevents bacterial colonization on the surfaces of biomedical devices.The rationale of the study depends on the prevention of microorganism colonizationon different surfaces by blocking the communication of these microorganismsthrough a non-biocidal method. The key molecule of this method is AcylHomoserine Lactone (AHL), which is a signal molecule used for the communicationof microorganisms. These AHL molecules are produced by the microorganisms andsecreted out of their cells. These molecules are sensed by other microorganisms andwhen its density reaches the threshold level, it is taken back to the microorganismsand activates the expression of several genetic elements (virulence factors, antibioticresistance genes etc.). This communication system is called as `Quorum Sensing`.The blocking of this communication (`Quorum quenching`) is vital to prevent thecolonization of microorganisms and infection. In order to achieve this blocking, AHLmolecule is the target in our study. Here, analogues of this AHL molecule has beenused to block the biofilm formation. Inhibitory effect of AHL analogues 5-(dibromomethylene)-3-methylfuran-2(5H)-one (named as FU1), 3-(bromomethyl)-5-(dibromomethylene) furan-2(5H)-one (named as FU2), (Z-)-4-Bromo-5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone (named as 4Z), 5-(Bromomethylene)-2(5H)-furanone (named as 2(5H)) have been examined. Synergistic antimicrobial agent andimmobilized AHL analogues composition as inhibitors for adhesion ofmicroorganism have also been investigated.xxFuranone molecules are a part of the chemical defense system produced by marinealgae named as Delisea pulchra, which prevents the colonization on their surfaces[1]. Furanones have been found to interfere with quorum sensing mechanism ofmany human pathogens and in previous works, these compounds and their analogueshave been shown to inhibit or prevent the growth of both Gram-negative and Grampositive bacteria [2-4]. These molecules act on intercellular communication systemboth as free molecules and also as surface immobilized molecules [5].Natural and synthetic furanone compounds have been found to interfere withQuorum Sensing (QS) mechanism of many human pathogens and block this specificpathway. Thus, the strategy for the present study is covalently linking furanonederivatives on surfaces to assess the effect of the immobilized furanone molecules onthe adhesion strength of Pseudomonas aeruginosa biofilms.Our goal is to inhibit formation of bacterial biofilm especially for medicalapplications. In the scope of the literature work, the strategy is to coat the surfacewith halogenated furanone derivatives.To obtain surface-immobilized furanones through the sol-gel processes, carbodiimidechemistry and azide-nitrene chemistry have been carried out. In the literature, theimmobilization procedure of furanone molecules starts with amine plasma, followingpolyacrylic acid and 4-azidoaniline treatment to obtain nitrene groups on to thesurface, which will be the linker of furanone under UV light.In this study, furanone molecules have successfully covalently bound to thesubstrate. Morphological differentiation at each step has been visualised by usingAFM and SEM. FTIR results are also coherent with AFM and SEM. PAAattachment has radically increased surface roughness (from 2.059 ± 0.05nm SS-SC to6.821 ± 0.75) and created niche areas for bacterial attachments. Change in surfacemorphology also effected CFU counts.CFU counts and CSLM images showed that FU1 and FU2 are highly effectiveagainst biofilm formation and FU2 has superior activity compared to FU1. FU2 hasinhibited 78.9% of bacterial adhesion onto the surface while FU1 reduced 65.4%when compared the surface without furanone. 4-Z and 2-5(H) have no activityagainst biofilm formation. The total bacterial reduction is 4 times higher than AZAsamples and 5 times higher when compared with uncoated SS-SC samples.Tobramycin asserts antibacterial activity when applied with furanone derivatives andit further reduced attachment of bacteria (96.3% reduction for FU2 and 79.4%reduction for FU1) when compared with tobramycin untreated samples (76%reduction for FU2 and 60% reduction for FU1).Furanone coated substrates were tested in vivo using foreign-body infection model.68 % mice died before 24th hour of the experiment and furanone coated substrateshad higher CFU counts compared to control samples. The relationship betweeneDNA concentration and CFU also assessed with this experiment and it has beenfound that eDNA concentration is proportional to CFU count.This project was performed as a collaboration between Istanbul Technical Universityin Turkey and the research group from Instituto di Chimica del RiconoscimentoMolecolare at CNR (National Research Council) in Italy. Italian group worked onchemical grafting of protease and lysozyme on to the stainless steel coupons andcarried out the ATR-FTIR imaging of both the surface coatings and the biofilmsamples. Chemically grafted stainless steel surfaces were provided by CNR group.xxiArcelik A.S. (partner company from industry) also partly contributed to the projectby providing scholarships to researchers. CSLM experiments and animal studieswere carried at the University of Copenhagen, Denmark.

92