A conservação in vitro é uma estratégia de conservação ex situ que garante a manutenção da integridade genética e biológica das espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de agentes osmóticos e temperatura na conservação in vitro de Syngonanthus mucugensis Giul. subsp. mucugensis. Os brotos foram inoculados em meio de cultura MS ½ contendo 7g L-1 de ágar e suplementado com 60g L-1 de sacarose, e com as concentrações de sacarose 15, 30 e 45g L-1 combinados com 0 e 15g L-1 de sorbitol ou manitol. As culturas foram mantidas em duas temperaturas (18 e 25°C). A porcentagem de sobrevivência das plantas foi avaliada mensalmente e ao final de 180 dias foram analisados o comprimento da parte aérea e da raiz, a porcentagem de folhas verdes, a porcentagem de explantes com brotos, o número de brotos por explante e o comprimento dos brotos. Os agentes osmóticos promoveram um decréscimo no crescimento das plantas, no entanto reduziram a sua viabilidade. Os resultados observados nos experimentos mantidos a 18°C foram significativamente superiores aos encontrados a 25°, para todas as variáveis analisadas. A conservação de S. mucugensis subsp. mucugensis pode ser feita à 18°C em meio de cultura MS ½ contendo 15g L-1 de sacarose, por até 180 dias, sem subcultivo.The in vitro conservation is an ex situ conservation strategy that ensures the maintenance of genetic and biological integrity of species. The present study evaluated the effects of, osmotic agents and different temperature regimes on the in vitro conservation of Syngonanthus mucugensis Giul. subsp. mucugensis. The shoots were inoculated into half salt strength Murashige and Skoog culture medium (MS ½) containing 7g L-1 of agar. The culture medium was supplemented with 60gL-1 sucrose and with the sucrose concentrations 15, 30 and 45g L-1 combined with 0 and 15g L-1 of sorbytol or mannitol. Two different temperatures were used in these experiments (18 and 25°C). The percentage of plant survival was evaluated monthly and at 180 days were analyzed length of shoot and root, the percentage of green leaves, the percentage of explants with shoots and number of shoots per explants and shoot length. The addition of osmotic agents resulted in decreased growth of the plants and therefore reduced their viability. The averages observed in the experiments undertaken at 18°C were significantly superior to those observed at 25°C for all of the variables analyzed. S. mucugensis subsp. mucugensis can be cultured at 18°C in MS½ culture medium containing 15g L-1 of sucrose, for up to 180 days, without subculturing.