Objetivos: comparar o desempenho das amostras do canal cervical e fundo de saco vaginal para o exame colpocitológico no diagnóstico da neoplasia do colo uterino. Métodos: foram constituídos três grupos seqüenciais: grupo 1) 10.048 mulheres com amostras da ectocérvice e fundo de saco, utilizando espátula de Ayre; grupo 2) 3.847 mulheres com amostras da ectocérvice, fundo de saco e canal cervical, utilizando espátula de Ayre e escova cytobrush; grupo 3) 4.059 mulheres com amostras da ectocérvice e canal cervical, utilizando espátula de Ayre e escova cytobrush. A metodologia estatística utilizou análise de variância (ANOVA) e comparação de proporções. Resultados: os percentuais de exames alterados dos grupos 2 (2,6%) e 3 (2,4%), incluindo todas as lesões escamosas e glandulares, foram significativamente maiores que no grupo 1 (2%). Os percentuais de diagnóstico da lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LIE-BG) não foram estatisticamente diferentes entre os três grupos (1,27; 1,25 e 1,07%). Por outro lado, os percentuais de diagnóstico da lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (LIE-AG) foram significativamente maiores nos grupos 2 (0,81%) e 3 (0,77%) do que no grupo 1 (0,54%). A diferença entre os percentuais dos grupos 2 e 3 não foi estatisticamente significante. Conclusões: a amostra do canal cervical melhora o desempenho do exame colpocitológico para o diagnóstico da lesão intra-epitelial escamosa de alto grau, ao passo que a amostra de fundo de saco não interfere significativamente nos percentuais de diagnóstico das lesões intra-epiteliais.Purpose: to compare the performance of cervical canal and vaginal cul-de-sac samples for colpocytology testing, in order to diagnose cervical neoplasia. Methods: three sequential groups were constituted: group 1 - 10,048 women with ectocervix and cul-de-sac samples collected with the use of an Ayre spatula; group 2 - 3,847 women with ectocervix, cul-de-sac and cervical canal samples taken with an Ayre spatula and a cytobrush, and group 3 -- 4,059 women with ectocervix and cervical canal samples, using an Ayre spatula and a cytobrush. ANOVA (analysis of variance) and comparison of proportions were utilized for the statistical analysis. Results: the rates of abnormal tests in groups 2 (2.6%) and 3 (2.4%), including all squamous and glandular lesions, were significantly higher than in group 1 (2.0%). The diagnosis rates of low-grade squamous intraepithelial lesion (LGSIL) were not statistically different between the three groups (1.27, 1.25 and 1.07%). On the other hand, the diagnosis rates of high-grade squamous intraepithelial lesion (HGSIL) were statistically higher in groups 2 (0.81%) and 3 (0.77%) than in group 1 (0.54%). The difference between the rates of the second and the third groups did not present any statistical significance. Conclusions: the cervical canal sampling improves the performance of cytologic testing for the diagnosis of HGSIL, while cul-de-sac sampling does not change significantly the performance in diagnosing cervical neoplasia.