In the endodontic treatment of root canals with necrotic pulps associated with periapical radiolucent areas, one of the main objectives of treatment consists in eliminating the microorganisms spread throughout the ramifications of the root canal system. The scope of this study was to evaluate the antiseptic efficacy of biomechanical preparation and two calcium hydroxide-based pastes, in dogs' teeth with experimentally induced chronic periapical lesions. After initial microbiological sampling, instrumentation of the root canals was undertaken using the conventional technique, using K type files used in conjunction with a solution of 5.25% sodium hypochlorite. After ninety-six hours, further microbiological sampling was undertaken and Calen/CPMC or Calasept pastes were applied for 15 and 30 days. Ninety six hours after the removal of the medication, the third microbiological sampling was undertaken and finally histomicrobiological analysis followed using Brown & Brenn staining. The results were analyzed using the Kruskall-Wallis test, with a level of significance established at 5% (p0.05), characterized by an elevated incidence of cocci, bacilli and filaments, predominantly gram-positive, in root canals, secondary canals and accessories, apical cementoplasts and dentinal tubules, but with a low incidence of microorganisms in areas of cementum resorption and the periapical lesion. The biomechanical preparation and intracanal dressing based on calcium hydroxide were important in the antisepsis of the root canal; however, both procedures did not produce significant changes in the microbiological aspects of the root canal system.No tratamento endodôntico dos canais radiculares com polpa necrótica associados à áreas radiolúcidas periapicais, um dos principais objetivos consiste em eliminar os microrganismos situados em todo o sistema de ramificações. Por conseguinte, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia anti-séptica do preparo biomecanico e de duas pastas à base de hidróxido de cálcio, em dentes de cães com reações periapicais crônicas experimentalmente induzidas. Após amostragem microbiológica inicial, realizou-se a instrumentação dos canais radiculares pela técnica convencional, utilizando-se limas tipo Kerr coadjuvadas pela solução de hipoclorito de sódio a 5,25%. Noventa e seis horas após, obteve-se a segunda amostragem microbiológica e aplicou-se as pastas Calen/PMCC ou Calasept, por 15 e 30 dias. Noventa e seis horas após a remoção da medicação, obteve-se a terceira amostragem microbiológica e ulterior análise histomicrobiológica pela técnica de Brown & Brenn. Os resultados foram analisados pelo teste de Kruskall-Wallis, com nível de significância estabelecido em 5% (p0,05), caracterizado por elevada incidência de cocos, bacilos e filamentosos, predominantemente gram-positivos, situados no canal radicular, canais secundários e acessórios, cementoplastos apicais e túbulos dentinários, mas com baixa incidência de microrganismos nas áreas de reabsorção cementária e lesão periapical. O preparo biomecânico e o curativo de demora à base de hidróxido de cálcio foram importantes na anti-sepsia do canal radicular principal, contudo, ambos os procedimentos não proporcionaram significativas mudanças nos aspectos histomicrobiológicos do sistema de canais radiculares.