The Sinos River, in southern Brazil, is polluted by industrial discharges and untreated urban wastes. Fish genotoxicity biomarkers are valuable parameters for environmental risk assessment. In this study, we used the comet assay to detect genotoxicity due to multiple sources of pollution in the peripheral blood of a native fish species (Hyphessobrycon luetkenii). In addition, we analysed possible DNA damage from aluminum, lead, chromium, copper, nickel, iron and zinc contamination. Water samples were collected seasonally from three sampling sites and the fish were assessed under laboratory conditions. Water chemical analysis showed an increased level of aluminum and iron in most of the samples at sites 2 and 3, located in the middle and lower river course, respectively. The index of DNA damage assessed by the comet assay demonstrated no significant differences in different seasons or at the different sampling sites, while the frequency of cells with DNA damage was higher in water samples collected at sites 1 and 2 during the spring season. None of the metals studied seems to be associated with the increase in the frequency of cells with DNA damage observed during the spring season. The results of this study indicate that the Sinos River is contaminated with substances that are genotoxic to fish, including the waters near the river spring.O rio dos Sinos, no sul do Brasil, é poluído tanto por descargas industriais como por resíduos urbanos não tratados. Os biomarcadores de genotoxicidade em peixes são parâmetros valiosos para a determinação de risco ambiental. Neste estudo, utilizamos o ensaio cometa em sangue periférico de um peixe nativo (Hyphessobrycon luetkenii) para detectar a genotoxicidade devido a múltiplas fontes de poluição. Além disso, analisamos a possível influência da contaminação por alumínio, chumbo, cromo, cobre, níquel, ferro e zinco sobre o dano de DNA. Amostras de água foram coletadas sazonalmente em três pontos de coleta e os peixes foram expostos sob condições de laboratório. A análise química da água mostrou níveis elevados de alumínio e ferro na maioria das amostras dos pontos 2 e 3, localizados nos cursos médio e inferior do rio, respectivamente. O índice de dano de DNA estimado pelo ensaio cometa não demonstrou diferenças significativas tanto entre estações como entre pontos de coleta, enquanto que a frequência de células com dano de DNA apresentou valores superiores nas amostras de água coletadas durante a primavera nos pontos 1 e 2. Nenhum dos metais estudados parece estar associado com o aumento na frequência de células com dano de DNA observado durante a primavera. Os resultados deste estudo indicam que o rio dos Sinos está contaminado com substâncias genotóxicas para os peixes, incluindo as águas próximas à nascente do rio.