Objetivou-se avaliar o efeito do nível de produção de leite sobre o consumo e a digestibilidade dos nutrientes (MS, MO, EE, PB, FDNcp e CNF corrigidos), o consumo de NDT, a produção de proteína microbiana e a excreção de compostos nitrogenados na urina. Foram avaliadas as concentrações de N uréico no soro (NUS) e no leite (NUL) de animais de diferentes níveis de produção de leite. Foram comparadas as metodologias de coletas de urina spot e total para quantificação do fluxo de N microbiano. Quinze vacas holandesas foram alocadas em delineamento inteiramente casualizado, com três tratamentos, de acordo com a produção de leite: 5,88 (baixa); 18,54 (média) e 32,6 kg de leite/dia (alta). A dieta foi constituída de silagem de milho fornecida à vontade e 1 kg de concentrado para cada 3 kg de leite produzido. Os consumos de todos os nutrientes, exceto FDNcp, foram maiores nos animais mais produtivos. As digestibilidades de MS e MO e o teor de NDT não diferiram entre os tratamentos, mas as digestibilidades da PB e da FDNcp foram influenciadas pelo nível de produção, sendo maior e menor, respectivamente, nos animais de alta produção. Os teores de NUS e NUL e a excreção de compostos nitrogenados na urina foram altamente correlacionados e superiores nos animais mais produtivos, indicando que a concentração ótima varia com o nível de produção de leite. A produção microbiana não diferiu entre as metodologias de coleta spot e total de urina, sendo inferior nos animais menos produtivos. Assim, a coleta de urina spot pode ser utilizada para estimar a excreção de compostos nitrogenados na urina e a produção de proteína microbiana no rúmen.The objective of this trial was to evaluate the effect of milk production level on intake, digestibility of nutrients, microbial protein synthesis, and nitrogen (N) metabolism in Holstein cows. It was also of particular interest to compare spot urine sampling and total urine collection as methodologies to quantify yield of microbial N using purine derivatives (PD) as indirect microbial markers. Fifteen Holstein cows were grouped by milk yield (5.88 kg/day: LOW treatment; 18.54 kg/day: MEDIUM treatment; and 32.6 kg/day: HIGH treatment) and data analyzed as a completely randomized design. Animals were fed ad libitum corn silage plus one kg of concentrate per each three kg of milk produced. Except for NDF corrected for ash and protein (NDFap), intake of all remaining nutrients was increased by milk yield. Digestibilities of DM and OM and dietary TDN content did not differ among treatments. However, digestibility of CP was higher and that of NDFap was lower on the greatest milk yielding cows (HIGH treatment). Concentrations of milk urea N and serum urea N as well as urinary N excretion were all greatest in the HIGH treatment and were also highly correlated with milk yield. Microbial protein synthesis estimated by PD was lowest on cows in the LOW treatment and did not differ when either spot urine sampling or total urine collection was used. Therefore, spot urine sampling can be used to estimate urinary excretion of nitrogenous compounds and microbial protein synthesis in Holstein cows with different production levels.