El tomate de árbol (Solanum betaceum) es un frutal de origen andino que posee el potencial necesario para convertirse en un producto de importancia económica dentro de los mercados internacionales de exportación. El objetivo principal de esta investigación fue estandarizar un protocolo para el aislamiento de protoplastos a partir de hojas, y la obtención de plantas viables de tomate de árbol. Las modificaciones incorporadas al protocolo original permitieron obtener división de los protoplastos en todos los ensayos. Con la metodología utilizada, se obtuvo un promedio de eficacia de extracción y aislamiento de protoplastos de 4, 21 x 105 protoplastos por ml. La eficiencia de formación de callos a partir de los protoplastos aislados fue baja con valores en promedio de 0, 11%. Sin embargo, la regeneración de retoños a partir de los callos obtenida fue exitosa y se lograron valores de hasta el 68%. Los resultados de esta investigación demuestran que la regeneración de retoños a partir protoplastos en tomate de árbol es eficaz. En esta investigación se obtuvo plantas viables de tomate de árbol regeneradas a partir de protoplastos, lo que constituye un paso primordial para estudios posteriores, como hibridación somática, transformación genética o inducción de variación somaclonal. Técnicas que pueden contribuir al establecimiento de programas de fitomejoramiento que ayuden a incrementar los niveles de producción de esta planta.