Prozessentwicklung und Produktion von Wirkstoff-Metaboliten durch Ganzzellbiotransformation im Gramm-Maßstab mit humanem Cytochrom P450 exprimiert in E. coli

Doctoral thesis German OPEN
Jahn, Berengar (2008)

Cytochrom P450 (CYP) umfasst eine ubiquitär verbreitete Enzymüberfamilie mit einem sehr breiten Substrat- und Reaktionsspektrum. Im menschlichen Körper spielt CYP im Stoffwechsel von Medikamenten eine zentrale Rolle. In der pharmazeutischen Forschung werden aufgereinigte Wirkstoff-Metaboliten für die Strukturaufklärung, als Vergleichsstandard für die Pharmakokinetik und für die Klärung toxikologischer Risiken im Rahmen der Arzneimittelzulassung benötigt. Bisherige chemische oder mikrobiologische Herstellungsverfahren sind aufwendig und langwierig. Bakterielle Ganzzellkatalysatoren, die funktionelle humane CYP Redoxsysteme exprimieren, bieten die Möglichkeit einer schnellen und kostengünstigen Produktion von humananalogen Wirkstoff-Metaboliten. Diese Arbeit befasst sich mit der Etablierung von CYP-exprimierenden E. coli-Zellen als Ganzzellkatalysatoren, um erstmalig humananaloge Wirkstoff-Metaboliten im Gramm-Maßstab herzustellen. Für die Bereitstellung von Zellmaterial wurde ein hochzelldichtes Fermentationsverfahren am Beispiel von CYP3A4 und CYP1A2 optimiert. Das Verfahren beinhaltet eine Sauerstofflimitation, welche für eine effiziente CYP-Expression notwendig ist, und basiert auf einer pH-Wert-abhängigen Glukosezugabe. Im 10 L Maßstab wurden reproduzierbar eine OD550nm von 55 erreicht und 1550 nmol/L CYP3A4 exprimiert, die bisher höchste erzielte Konzentration an CYP3A4. Bei CYP1A2-Fermentationen wurden Proteinkonzentrationen von bis zu 950 nmol/L nachgewiesen. Das per Zentrifugation geerntete Zellmaterial war durch Kryokonservierung problemlos über Monate hinweg für Biotransformationen einsetzbar. Metaboliten wurden durch Ganzzellbiotransformationen mittels CYP3A4 von Testosteron, Nifedipin, MENT und 5-Acetyliminodibenzyl sowie mittels CYP1A2 von Phenacetin produziert. Beispielsweise wurden 5 g Testosteron von drei Monate lang kryokonserviertem Zellmaterial aus einer 10 L Fermentation innerhalb von 3 h zu über 95 % umgesetzt. Von dem Hauptmetaboliten, der zu 69 % entstand, wurden 2147 mg durch Extraktion und Chromatographie gewonnen. Diese Menge übersteigt bisher beschriebene Mengen an isolierten Metaboliten um mehr als das Zwanzigfache. Bei dieser Biotransformation wurden darüber hinaus 347 mg an weiteren, teilweise unbekannten Metaboliten isoliert und von 13 die Struktur aufgeklärt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass mit dem entwickelten Verfahren aktives Zellmaterial vorausschauend produziert werden kann, um bei Bedarf die Produktion humananaloger CYP-Metaboliten von Wirkstoff-Kandidaten im Gramm-Maßstab innerhalb kürzester Zeit zu erlauben. Der entwickelte Prozess ist kostengünstiger als alternative Verfahren und kann zu einer schnelleren Arzneimittelentwicklung beitragen. Cytochrom P450 (CYP) comprises an ubiquitous enzyme superfamily with a wide sub-strate specificity and a broad reaction spectrum. In humans CYP is of importance for metabolism of drugs. In pharmaceutical research purified drug metabolites are used for structure elucidation, as reference standards in pharmacokinetics and for the toxicologi-cal risk assessment within the scope of drug approval. Current chemical or microbiological manufacturing methods are extensive and time-consuming. Bacterial whole cell catalysts, expressing functional human CYP redox systems, offer the opportunity of a fast and cost-effective production of human analogous drug metabolites. The present studies were undertaken in order to implement CYP expressing E. coli cells as whole cell catalysts to facilitate the large-scale production of human analogous drug metabo-lites. A high cell density fermentation process was optimized for preparation of active cells in exemplarily for CYP3A4 and CYP1A2. The fed-batch process is based on a pH-dependent feeding strategy and uses oxygen limitation as a prerequisite for efficient CYP expression. In the 10-L-scale an OD550nm of 55 was reproducibly obtained and up to 1550 nmol/L CYP3A4 was expressed, the highest documented concentration for a complete redox system expressed in E. coli so far. Expression levels of CYP1A2 fermentations reached up to 950 nmol/L. The biomass was harvested by centrifugation and a long-term storage by cryopreservation before its application as a biocatalyst was unproblematic. CYP3A4 metabolites of testosterone, nifedipine, MENT and 5-acetyliminodibenzyl as well as CYP1A2 metabolites of phenacetin were produced by whole cell biotransforma-tion. For instance, 5 g testosterone was more than 95 % metabolized within 3 h by the biomass of one 10 L fermentation. 2147 mg of the main metabolite could be recovered from the crude extract by chromatographic separation techniques. This amount exceeds described amounts of isolated metabolites by twenty times. Moreover, 347 mg of partially unknown minor metabolites were isolated, and the structures of 13 were determined. The results of theses studies clearly demonstrate the possibility of providing active bio-mass for fast and large-scale drug metabolite production on demand. The developed process is more cost-effective than alternative production methods and will contribute to a faster drug development.
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