Identificação de genes associados a produção de ocratoxina A em Aspergillus westerdijkiae

Doctoral thesis Portuguese OPEN
Daniele Sartori (2009)
  • Publisher: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia.
  • Subject: Microbiologia | Aspergilos | Ocratoxinas | Microbiology | Aspergillus

Micotoxinas, metabólitos secundários de fungos, são compostos tóxicos encontrados em uma grande variedade de alimentos que, quando ingeridos, podem colocar em risco a saúde humana e animal. Dentre as diversas micotoxinas, especial interesse tem sido dado à ocratoxina A (OA), produzida por algumas espécies de Aspergillus e Penicillium. Esta micotoxina é encontrada com frequência principalmente em alimentos como grãos e uvas e, quando ingerida e acumulada, pode causar efeitos como, nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, imunossupressão e carcinogenicidade. Ocratoxinas são formadas a partir de pentacetídeos cíclicos, derivados de dihidroisocumarina e ligados a L-fenilalanina, entretanto, informações sobre a síntese e a regulação da OA ainda são limitadas. Este trabalho teve por objetivo identificar genes e proteínas com expressão diferencial entre linhagens produtoras e não produtoras de OA, com auxílio das técnicas de Análise da Expressão Diferencial (RDA), Análise Proteômica, e PCR em Tempo Real. Inicialmente, foram obtidos fragmentos gênicos (aproximadamente 400 pb) diferencialmente expressos entre a linhagem produtora (UEL91) e não produtora (ITAL163) de OA, cultivadas em meio permissivo (YES). Aproximadamente 260 transcritos foram obtidos, dos quais três oxidases denominadas de P450-AL, P450-PH e OXI-1 foram de especial interesse. As oxidases P450-AL e OXI-1 apresentaram maior expressão diferencial (32 e 20 vezes, respectivamente), o que foi confirmado por PCR em Tempo Real. Por isso, genes codificadores destas duas oxidases foram avaliados quanto à associação entre a quantidade de OA e de transcritos expressos em meio de cultura permissivo (YES), semi-permissivo (CY) e restritivo (EM) à produção de OA. Foi encontrada associação entre o nível de transcritos e a presença de OA para ambos os genes, embora em diferentes magnitudes. Em um segundo estudo, foi usado uma linhagem mutante de Aspergillus westerdijkiae (ITAL142-T10) com reduzida produção de OA. Este mutante possui um gene interrompido pela integração de um T-DNA, similar ao loco An09g05800 de Aspergillus niger, que codifica um possível fator de transcrição PHD (Rum1), envolvido em eventos regulatórios mediados pela cromatina. A linhagem mutante (ITAL142-T10) foi usada para a análise proteômica diferencial com a linhagem selvagem (ITAL142), em meio permissivo à produção de OA, com o objetivo de identificar proteínas que estão sob a regulação do fator de transcrição PHD. Dentre 23 proteínas identificadas com maior expressão na linhagem selvagem, a maior frequência foi de proteínas de resposta a stress (36,4%) e da subunidade regulatória 26S do proteassoma (9,1%). Devido a ser usual o compartilhamento de genes regulatórios da biossíntese de micotoxinas e do processo de esporulação em fungos, foi feito uma análise dos conídios (produção e características morfológicas) de ITAL142 e ITAL142-T10 nos meios MEA e YES. Nenhuma alteração quanto à conidiação foi observada em MEA, no entanto, em YES, houve a formação de maior número de conídios. Em seguida, a quantidade de transcritos relacionados às proteínas 14-3-3 e à subunidade regulatória 26S do proteassoma foi analisada via PCR em Tempo Real. Para ambos, foi detectada expressão relativa maior em ITAL142 comparativamente à de ITAL142-T10, confirmando os dados de expressão diferencial observada pela análise proteômica. Em síntese, os dois estudos permitiram identificar genes associados à produção de OA. Mycotoxins, secondary metabolites of fungi, are toxic compounds found in great variety of foods, and when ingested can be very hazardous to animal and human health. Among the diverse mycotoxins, special interest has been given to the ochratoxin A (OA), produced by some species of Aspergillus and Penicillium. This mycotoxin is frequently found mainly in food such as grains and grapes, and when ingested and accumulated they can cause nephotoxicity, hepatotoxicity, immunossupressive and carcinogenic effects. Ochratoxins are formed from cyclic pentaketides, derived from dihydroisocoumarin linked to L-phenylalanine, but information on their biosynthesis and regulation are still limited. The objective of this study was to identify genes and proteins with differential expression between OA producing and non-producing strains, using the techniques Representational Differential Analysis, Proteomic Analysis and Real Time PCR. Initially, differentially expressed genic fragments (400 bp approximately) were obtained between OA producing (UEL91) and non-producing strains (ITAL163) grown in the permissive medium (YES). Approximately 260 transcripts were obtained and three oxidases denoted P450-AL, P450-PH and OXI-1 were of special interest. The oxidases P450-AL and OXI-1 showed a higher differential expression (32 and 20-fold respectively), and this result was confirmed through Real Time PCR. Due to this fact, both oxidases genes were analyzed for the association between the amount of OA produced and transcripts expressed in permissive (YES), semi- permissive (CY) and restrictive (EM) media for the production of OA. Association was found between the level of both gene transcripts and the amount of OA, although in different magnitudes. In a second study, it was used a mutant strain of Aspergillus westerdijkiae (ITAL142-T10) with reduced OA production. This mutant has an interrupted gene by a T-DNA integration, similar to the locus An09g05800 of Aspergillus niger which codes for a putative transcription factor PHD (Rum1), involved in chromatin-mediated regulatory events. The mutant strain (ITAL142-T10) was used for differential proteomic analysis with the wild type strain (ITAL142) grown in permissive medium for OA production, with the objective of identifying possible proteins under regulation of the transcription factor PHD. Among the 23 proteins with higher levels of expression in the wild type strain, proteins of stress response (36.4%) and the regulatory subunit 26S of the proteasome (9.1%) were the ones with highest frequency. Being usual the sharing of regulatory genes involved in mycotoxin biosynthesis and with the process of fungi sporulation, an analysis of conidia (production and morphological characteristics) was carried in ITAL142 and ITAL142-T10 in MEA and YES media. No alteration was found regarding conidiation in MEA, but a greater number of conidia were observed in YES medium. Then, the proteins, 14-3-3 and the regulatory subunit 26S of the proteasome were transcriptionally analyzed by Real Time PCR. Both transcripts showed higher relative expression in ITAL142 compared to ITAL142-T10, confirming the data of differential expression observed by the proteomic analysis. Thus, both studies brought contributions concerning the elucidation of genes associated with OA biosynthesis.
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