APLICACION DE TECNICAS DE INGENIERIA METABOLICA AL MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCION DE TREHALOSA POR CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM.

Doctoral thesis English OPEN
PADILLA IGLESIAS, LEANDRO MAURICIO (2004)
  • Subject: INGENIERIA Y TECNOLOGIA | Conocimiento General | TECNOLOGIA Y CIENCIAS DE LA INGENIERIA

La Trehalosa es un disacárido con tremendas aplicaciones en la industria biotecnológica y alimenticia. Este compuesto se encuentra en muchos organismos, a causa de su capacidad de proteger las células contra el calor y la deshidratación. Un ejemplo, es la bacteria Gram-positiva Corynebacterium glutamicum, la cual sintetiza trehalosa a través de dos rutas principales, TreYZ y OtsBA, usando ADP-glucosa (especulativamente) y UDP-glucosa, respectivamente, como dadores de unidades de glucosa. Para aprovechar esta capacidad, propusimos una estrategia para la producción industrial de trehalosa, basada en cepas mejoradas de C. glutamicum. De esta forma, el objetivo principal de esta Tesis fue el desarrollo de cepas recombinantes de C. glutamicum capaces de sintetizar trehalosa con mayores rendimientos. El primer objetivo de esta investigación fue la mejora de una ruta terminal de síntesis de trehalosa (ruta OtsAB) en C. glutamicum, a través de la expresión heteróloga del operón oIsBA de Escherichia coli, el cual codifica las enzimas trehalosa-6-fosfato sintasa (OtsA) y trehalosa-6-fosfato fosfatasa (OtsB). La nueva cepa recombinante, C. glutamicum otsBA, mostró un aumento de cinco a seis veces en la actividad de las enzimas de la ruta OtsAB, comparada a una cepa control, como también un aumento de cuatro veces en la productividad específica de trehalosa (q) durante crecimiento exponencial, y un aumento al doble en la concentración final de trehalosa en el medio de cultivo. La expresión heteróloga del operón otsBA resultó en una reducción del consumo específico de glucosa, como también de los flujos a través del ciclo de Krebs y de la vía de las pentosas (consecuencia de la caída en la expresión de las enzimas glucosa-6-P y 6-fosfogluconato deshidrogenasas). La baja actividad de la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa en extractos crudos de C. glutamicum, sugirió la limitación de UDPglucosa durante la síntesis de trehalosa. Por lo tanto, el segundo objetivo de esta Tesis, fue el aumento de la disponibilidad de UDP-glucosa en C. glutamicum, a través de la expresión heteróloga M gen que codifica la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa (galU) de E. coli, tanto en forma aislada como co-expresado con el operón otsBA de E.coli (operón sintético galUotsBA). La expresión del operón sintético gal UotsBA resultó en un aumento de seis veces en la cantidad de trehalosa acumulada y excretada, como también en un valor de q casi veinte veces superior (durante crecimiento exponencial) y una concentración final de trehalosa cuatro veces superior, en relación a la cepa control. Sorprendentemente, la expresión aislada de galU, también resultó en un aumento significativo de la acumulación de trehalosa. Para investigar el rol de las rutas OtsAB y TreYZ en este incremento, se llevó a cabo la expresión del gen galU y el operón sintético gal UotsBA en una cepa mutante del gen treY. El incremento de la síntesis de trehalosa fue reducido levemente en la cepa gal UotsBA AtreY, lo cual demostró la participación de ambas rutas, aunque la contribución de la ruta OtsAB fue mayoritaria. Por otro lado, la expresión del gen galU en la cepa galUAtreY resultó en una reducción pronunciada de la acumulación y excreción de trehalosa, y en una acumulación significativa de glicógeno, lo cual demostró la prevalencia de la ruta TreYZ durante la síntesis de trehalosa en esta cepa. Dos funciones hipotéticas de UDP-glucosa, durante la síntesis de glicógeno en C.glutamicum, fueron propuestos: (i) sustrato de la síntesis de glicógeno, en adición a ADP-glucosa, y (ji) inhibidor de una vía hipotética para la degradación de ADP-glucosa. El tercer objetivo de esta investigación fue la exploración de modificaciones adicionales del metabolismo central, orientadas al mejoramiento de la síntesis de trehalosa. Para este fin, se determinó el impacto de la expresión del gen galU y el operón gal UotsBA en los parámetros de crecimiento, y en las distribuciones de flujos metabólicos durante crecimiento en bioreactor. Para obtener una medida de la eficiencia de las nuevas cepas, las distribuciones de flujos correspondientes fueron comparadas a una distribución de flujos óptima para la síntesis de trehalosa (calculada a partir de un modelo estequiométrico subdeterminado). Este análisis demostró que los flujos, con pocas excepciones, tienden a converger hacia el óptimo a través del mejoramiento genético (en la fase exponencial tardía de crecimiento). Además, a través del análisis estequiométrico de la red metabólica de C. glutamicum, fue posible proponer el desacoplamiento del consumo de glucosa (mediado por el sistema fosfotransferasa) y el flujo glicolítico como una forma de incrementar el rendimiento de trehalosa en glucosa. Para probar esta proposición, el gen de E. colé ppsA - el cual codifica la enzima fosfoenolpiruvato sintetasa - fue expresado en C. glutamicum. La nueva cepa, C. glutamicum ppsA, mostró incrementos en la excreción de trehalosa y ácidos orgánicos, comparada a una cepa control. Para integrar el mejoramiento de las rutas terminales y centrales, ppsA fue coexpresado con galU. Sin embargo, esta modificación no rindió los resultados esperados. De hecho, la acumulación de glicógeno y trehalosa se redujo en relación a la cepa galU. Este resultado fue asociado a mecanismos regulatorios desconocidos, los cuales operarían durante la sobreexpresión de ppsA. Estos mecanismos enmascararían los efectos predichos por el análisis estequiométrico, donde dichos mecanismos regulatorios complejos no son tomados en cuenta. La Trehalosa es un disacárido con tremendas aplicaciones en la industria biotecnológica y alimenticia. Este compuesto se encuentra en muchos organismos, acausa de su capacidad de proteger las células contra el calor y la deshidratación. Unejemplo, es la b 161p.
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