Sistemas microfluídicos amperométricos utilizando enzimas imobilizadas

Master thesis Portuguese OPEN
Luís Marcos Cerdeira Ferreira (2011)
  • Publisher: Universidade de São Paulo
  • Subject: Amperometria | Amperometry | Análise em fluxo | Enzymatic immobilization | Flow analysis | Glicose | Glucose | Imobilização enzimática | Microfluidic systems | Sistemas microfluídicos | Química

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.
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