Epidemiologia molecular de papilomavírus bovino identificados em sarcoides equinos

Master thesis Portuguese OPEN
Brígida Kussumoto de Alcântara (2013)
  • Publisher: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal.
  • Subject: Equino - Doenças | Doenças do vírus do papiloma | Viroses em animais | Virologia veterinária | Epidemiologia molecular | Horse | Diseases | Papillomavirus diseases | Virus diseases in animals | Molecular epidemiology

Em equinos os sarcoides são considerados tumores fibroblásticos de pele mais comuns e raramente apresentam regressão espontânea. Os papilomavírus bovino (BPV) tipos 1 e 2 estão envolvidos na etiologia dos sarcoides e, provavelmente, o BPV13 descrito recentemente também pode apresentar participação na etiopatogenia destes tumores. O objetivo do presente estudo foi definir a epidemiologia molecular do BPV em uma coleção de 20 espécimes de sarcoide equino de 15 animais provenientes de quatro regiões do Brasil. No total, foram avaliadas amostras de 20 sarcóides sendo 12 de material fresco e 8 de tecido fixado em formaldeído e emblocado em parafina. A presença de tumores fibroblásticos tipo sarcoide foi confirmada em 18/20 as amostras por meio da técnica de histopatologia. A amplificação do DNA de BPV nas amostras de sarcoides incluídas no estudo foi realizada por meio da técnica de PCR utilizando três pares distintos de primers. O primeiro par de primers, IDFNR-2/IDNT-2, que amplifica 102 pb da ORF L1 do PV, foi utilizado para triagem das amostras. O segundo par utilizado amplifica uma sequência comum da ORF E5 e parte da L2 dos BPVs do gênero Deltapapillomavirus. O terceiro par foi o FAP59/FAP64, que amplifica 480 pb do gene L1 do PV de diversas espécies animais. Na PCR de triagem foi possível obter amplicons nas 20 amostras de sarcoides avaliadas. O produto do tamanho esperado de 250 pb foi obtido em todas as amostras submetidas à PCR utilizando os primers E5L2. Entretanto, a PCR realizada com os primers FAP produziu amplicons somente nas amostras de sarcoides provenientes de material fresco. Após o sequenciamento de nucleotídeos dos produtos amplificados, foi possível realizar duas análises filogenéticas, uma tendo como base o produto amplificado na região E5L2 e outra baseada na sequencia obtida com os primers FAP. Na análise do fragmento E5L2, nas 20 amostras de sarcoide processadas foi possível identificar os tipos BPV1, 2 e 13 em 14 (70%), 2 (10%) e 4 (20%) amostras, respectivamente. Nos produtos obtidos com os primers FAP foi possível identificar os tipos BPV1, 2 e 13 somente nas amostras de sarcoides provenientes de material fresco sendo que os resultados obtidos com os primers E5L2 e FAP foram coincidentes. Em dois animais foi possível avaliar mais de uma lesão. Um animal apresentou infecção singular com o BPV1 nas três lesões analisadas. O outro animal, em quatro lesões, foi possível identificar infecção mista com os três tipos de BPVs do gênero Deltapapillomavirus (BPV1, 2 e 13). Esse é o primeiro relato da identificação simultânea de três tipos distintos de BPVs, todos do gênero Deltapapillomavirus, em lesões de sarcoides provenientes de um mesmo animal. O presente estudo ratificou o envolvimento do BPV1 e 2 na etiologia do sarcoide, e reforça a importância da participação do BPV13 na etiopatogenia deste tumor fibroblástico em equinos. Sarcoids are the most common fibroblastic tumors of equine skin and rarely show spontaneous regression. The bovine papillomavirus (BPV) types 1 and 2 are classically involved in the pathogenesis of sarcoid, and probably the new BPV type (BPV13) described have also a participation in the pathogenesis of sarcoid. The present study attempted to characterize the BPVs DNA in equine sarcoid from 15 horses of four Brazilian regions. In total, 20 samples of cutaneous lesions were processed, 12 of fresh tissue and 8 of formalin fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. The samples were confirmed as sarcoid by routine histopathology. Three primers set were used to identify the BPV DNA by PCR assays. The consensus primer set IFNR-2 and IDNT-2 was used as screening to amplify a 102 bp fragment of the papillomavirus (PV) L1 ORF. The second primer set used is complementary to a common sequence of the E5L2 ORF of BPV1, 2, and 13. The third primer pair used was FAP59 and FAP64, which target sequence is a fragment of approximately 480 bp of L1 ORF of PVs. The screening PCR yielded amplicons in all samples. The amplicons of the expected length, approximately 250 bp, were obtained in 20 DNA samples by the PCR using E5L2 primer set. The FAP PCR yielded amplicons only in fresh samples. After nucleotides sequencing of the amplicons, two phylogenetic analyses were performed, one based on fragment E5L2 and other based on the sequence of L1 obtained with FAP primer. In E5L2 amplicons from 20 sarcoids were identified BPV1, 2, and 13 in 14 (70%), 2 (10%), and 4 (20%) samples, respectively. FAP amplicons allowed identifying BPV1, 2, and 13 only in fresh tissue samples, and the results were similar with E5L2 primers. In two equines with multiple lesions was possible to analyse more than one sarcoid tumor. One animal showed single infection with BPV1 and the other animal presented mixed infection with the three types of bovine Deltapapillomavirus (BPV1, 2, and 13). For the first time in a case of mixed infection in sarcoid, the three types of bovine Deltapapillomavirus were identified in a single animal. This study confirms the involvement of BPV1 and 2 in the pathogenesis of sarcoid and also showed the importance of BPV13 in the etiophatology of this fibroblastic tumor in equines.
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