Interações moleculares na adesão celular em suportes sólidos e o efeito de fotossensibilizadores porfirínicos

Doctoral thesis Portuguese OPEN
Patrícia Araújo dos Santos (2013)
  • Publisher: Universidade de São Paulo
  • Subject: Adesão celular | Cell adhesion | Estresse oxidativo | Fotoxidação | Oxidative stress | Photo-oxidation | Photodynamic therapy | Porfirinas | Porphyrins | RICM | Terapia fotodinâmica | Bioquímica

A adesão celular está ligada à formação e disseminação de metástases, a principal causa de óbito de pacientes diagnosticados com câncer. O objetivo deste trabalho foi investigar in vitro o efeito de fotossensibilizadores na adesão celular. Foram utilizadas porfirinas comerciais (PpIX, CPpI, TSPP, TMPyP e Zn(II)TMPyP) e um fotossensibilizador sintetizado através da ligação de poli-L-lisina à protoporfirina IX (PLLPpIX). A adesão celular foi estudada por RICM, técnica que permite quantificar a área de contato entre uma célula e um substrato por binarização das imagens digitais utilizando limiares apropriados. A técnica foi padronizada e revelou dois regimes de adesão celular: um limitado e outro não limitado pela quantidade de proteína de adesão adsorvida na superfície. Neste último foi observada lise celular. Todos os fotossensibilizadores estudados foram capazes de aumentar a adesão celular na ausência de irradiação comparados ao controle sem fotossensibilizador, o que não havia sido observado nos ensaios de resistência à tripsinização normalmente utilizados para estudar o efeito de fotossensibilizadores na adesão celular. Quanto maior a anfifilicidade do fotossensibilizador, maior foi o efeito na adesão, o que é explicado pela capacidade das moléculas em se intercalarem na membrana, mudando a sua rigidez. Este aumento da adesão no escuro correlaciona com a diminuição da migração segundo ensaios de ferida. A análise do padrão de expressão de integrinas na superfície celular revela que o aumento da adesão correlaciona com o aumento na expressão de αV. Quando os fotossensibilizadores estão concentrados na região perimembranar (1 minuto de incubação) e as células são irradiadas, há um aumento da adesão em relação ao controle sem fotossensibilizador, mas uma diminuição em relação ao controle tratado com o fotossensibilizador e não irradiado, o que implica que a PDT leva a uma diminuição da adesão celular e não a um aumento como reportado na literatura. Com 3h de incubação, PLLPpIX impede a adesão celular, enquanto PpIX praticamente não muda a adesão comparado ao controle não irradiado. Esta ausência do efeito da irradiação sugere que a PpIX afeta a adesão celular principalmente devido a sua intercalação na membrana e não devido à formação de espécies reativas. Com 3h de incubação os fotossensibilizadores não se encontram na membrana e, portanto, o efeito na adesão celular é indireto e também não está relacionado à diferenças na eficiência de internalização. O comportamento observado deve ter relação com diferenças de citolocalização. Outro processo que pode alterar a adesão celular é a oxidação das proteínas do soro fetal bovino. Como observado nos estudos de fotossensibilização de células, PLLPpIX foi capaz de impedir a adesão celular, diferentemente da PpIX. A maior eficiência da PLLPpIX foi associada a presença do polímero, o qual força por questões estéricas que a interação da PLLPpIX com a albumina, o componente majoritário do soro, fique restrita à superfície da proteína, deixando o fotossensibilizador disponível para interagir com o oxigênio molecular e gerar oxigênio singlete. Assim, a funcionalização com um polímero tornou a PpIX capaz de modular a adesão celular tanto agindo dentro da célula quanto na matriz extracelular. Cell adhesion is associated to the formation and spread of metastasis, the leading cause of death in cancer patients. The aim of this study was to investigate, in vitro, the effect of photosensitizers in cell adhesion. Five commercial porphyrins (PpIX, CPpI, TSPP, TMPyP e Zn(II)TMPyP) and Protoporphyrin IX covalently tethered to poli-L-lysine (PLLPpIX) were used. Cell adhesion was mainly studied by RICM, a technique that allows quantifying the contact area between a cell and a substrate for binarization of digital images using appropriate thresholds. The technique was standardized and disclosed two systems for cell adhesion: a system limited by the amount of adhesion proteina adsorbed on the surface and another one no limited, in which cell lysis was observed. All photosensitizers were able to enhance cell adhesion in the absence of irradiation compared to control without photosensitizer, which had not been observed in the trypsinization resistance tests usually used to study the effect of photosensitizers in cell adhesion. The greater the amphiphilicity of the photosensitizer, the greater was the effect on cell adhesion. This is explained by the ability of molecules to fit in the membrane, changing its tension. This increased adhesion correlates with the decrease in migration according to wound healing assays. Analysis of the integrin expression pattern on cell surface reveals that increased adhesion correlates with increased expression of alpha V. When photosensitizers are concentrated in the perimembranar region (1 minute of incubation) and cells are irradiated, there is an increase in adhesion when compared to control without photosensitizer, but a decrease relative to controls treated with the photosensitizer without irradiation, implying that PDT leads to a reduction of cell adhesion and not to an increase as reported in the literature. With 3h of incubation PLLPpIX prevents cell adhesion, while PpIX practically does not change the adhesion compared to dark control. This lack of effect of irradiation suggests that PpIX affects cell adhesion primarily because of its intercalation into the membrane and not due to the formation of reactive species. With 3h of incubation the photosensitizers are not on the membrane and therefore the effect on cell adhesion is indirect and it is not also related to differences in uptake efficiency. The observed behavior must be related to differences in subcellular localization arising from differences in molecular structure. Another process that can alter the cell adhesion is serum protein oxidation. As noted in the studies with cells, photosensitization of serum with PLLPpIX (but not with PpIX) was capable of preventing cell adhesion. The greater efficiency of PLLPpIX was associated with the presence of the polymer, which, by the steric hindrance, forces that interaction of PLLPpIX with albumin, the major serum component, is restricted to the protein surface, leaving the photosensitizer available to interact with molecular oxygen and generate singlet oxygen. Thus, the functionalization of a polymer has turned PpIX capable of modulating cell adhesion by acting both within and outside (in extracellular matrix) the cell
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