Ensaios in vitro com a linhagem celular ZF-L para análise dos efeitos de gasolina e efluentes de postos de combustível

Master thesis Portuguese OPEN
Débora Lachner (2013)
  • Publisher: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas.
  • Subject: Células - Peixe - Modelos biológicos | Organismos aquáticos | Hidrocarbonetos | Água - Poluição | Citotoxicidade | Cells | Fish | Biological models | Hydrocarbons | Aquatic organisms | Water | Pollution

O uso de linhagens celulares e bastante promissor como modelo biologico in vitro, tanto para a melhoria do rendimento dos testes de toxicidade quanto para reducao dos seus custos. Destaca-se no presente trabalho a utilizacao da linhagem celular permanente de hepatocitos de Danio rerio, denominada ZF-L. Diversos trabalhos comprovam a sensibilidade de ZF-L quando expostas a diversos contaminantes, com a utilizacao satisfatoria de diferentes biomarcadores. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade da fracao soluvel em agua da gasolina (FSG) e de um efluente de posto de combustivel (EF) para ZF-L. Para isso, foi feita a exposicao das celulas por 1, 3 e 6 h a diferentes diluicoes de FSG e EF. A FSG foi obtida simulando derrame de gasolina em ambiente tropical e o EF foi coletado do ultimo tanque de decantacao de um posto de combustivel. Antes da exposicao foram feitas diferentes diluicoes das solucoes teste em agua destilada, com adicao dos sais da salina tamponada com fosfato (PBS). Para verificacao da citotoxicidade, foram aplicados os testes de viabilidade celular por exclusao do azul de tripan (AT) e o de reducao do brometo de dimetiltiazol difeniltetrazolio (MTT), testando as diluicoes de 5, 10, 25 e 50% dos contaminantes. O controle foi feito expondo as celulas apenas ao PBS. A partir dos resultados obtidos pelo AT, foram selecionadas as diluicoes com viabilidade celular maior que 80% para aplicacao do ensaio do cometa, quantificacao de especies reativas de oxigenio (ERO) e capacidade antioxidante total (CAOT). Os resultados da viabilidade celular para ambos os poluentes, tanto para AT quanto para o MTT obedeceram a um padrao de resposta concentracaodependente. Demonstram tambem a maior citotoxicidade do EF em relacao a FSG, provavelmente devido a visivel presenca de detergentes em sua composicao. Para o ensaio do cometa, ERO e CAOT foram selecionadas as diluicoes de 5, 10 e 25% de FSG e 5 e 10% de EF. Com relacao a quantificacao de ERO e CAOT, foi verificada menor producao de ERO nas amostras expostas aos poluentes e CAOT aumentada em relacao ao controle, demonstrando que nas concentracoes e periodos de exposicao avaliados as ZF-L aumentaram suas defesas antioxidantes, evitando o estresse oxidativo. O ensaio do cometa indicou a alta genotoxicidade de FSG, com escores de dano proximos ao valor maximo (300), que seguiram um padrao concentracao-dependente. No caso das ZF-L expostas ao EF nao houve uma relacao concentracao-dependente na ocorrencia de danos no DNA e os escores apos 1 h foram maiores que o controle, mas apos 6 h foram significativamente menores nas amostras tratadas com EF que no controle, indicando uma possivel atuacao do sistema de reparo de DNA. Assim, e possivel afirmar que o EF apresentou alto potencial citotoxico enquanto a FSG apresentou alto potencial genotoxico para as ZF-L, nas concentracoes e nos tempos estudados, e que ZF-L apresenta-se como modelo biologico adequado para verificacao da qualidade ambiental. The development of in vitro biological models using cell lines is promising, both for improving the performance of the toxicity test as to reduce its costs. Several studies have confirmed the sensitivity of ZF-L, a permanent hepatocyte cell line of Danio rerio, when exposed to various contaminants, with the satisfactory use of different biomarkers. The aim of this study was to evaluate the toxicity of the gasoline water soluble fraction (GSF) and an effluent from a gas station (EF) for ZF-L. For this, ZF-L was exposed for 1, 3 and 6 h to different dilutions of GSF and EF. In order to obtain GSF, a simulation of gasoline spill in a tropical environment was made, and the EF was collected from the last settling tank of a fuel station. These solutions were both diluted in distilled water previously to the exposure of the cells. To check the cytotoxicity, two methods were applied: cell viability (CV) by Trypan Blue exclusion (TA) and dimethylthiazol diphenyltetrazolium bromide reduction (MTT) testing the dilutions of 5, 10, 25 and 50% of contaminants. The control cells were exposed only to phosphate buffered saline (PBS). With the results from TA, the dilutions with more than 80% CV were selected to proceed with comet assay, quantification of reactive oxygen species (ROS) and total antioxidant capacity (TAC). The CV results for both pollutants evaluated with AT and MTT methods showed a concentration-dependent response. They also demonstrated greater cytotoxicity of EF compared to GSF, probably due to the visible presence of detergent in its composition. In order to run the comet assay, ROS and TAC the following dilutions were selected: 5, 10 and 25% of GSF and 5 and 10% EF. Regarding the quantification of ROS and TAC, the results showed lower production of ROS in samples exposed to pollutants together with an increase in TAC in comparison to control, suggesting that at the concentrations and exposure periods evaluated in this work, the ZF-L increased their antioxidant defenses, preventing oxidative stress. The comet assay results indicated the genotoxic potential of GSF, since the scores of DNA damage were close to the maximum value (300), and also followed a concentration-dependent standard. As for the ZF-L cells exposed to EF the results showed that after 1 h the scores were higher than in control cells, but after 6 h they were significantly lower in samples exposed to EF in comparison to respective control, indicating a possible role of DNA repair system. In conclusion, it was demonstrated that EF has a cytotoxic potential while FSG showed high genotoxic potential for ZF-L, at the concentrations and exposure times evaluated in this study, and ZF-L appears as a biological model suitable for the assessment of environmental quality.
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