Dalam rangka pengembangan obat tradisional, telah dilakukan isolasi dan uji aktivitas antimikroba minyak atsiri daun legundi (Vitex trifolia, L.) familia Verbenaceae. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, menganalisis dan menguji aktivitas antimikroba minyak atsiri daun legundi. Isolasi dilakan dengan alat destilasi Stahl, diperoleh minyak atsiri sebanyak 0,02% v/b daun segar dan 0,08% v/b daun kering. Dari interpretasi data GC-MS tampak adanya 1,8 ???Cineole (17,83%), ???-terpinyl-acetate (8,38%), ???-caryophyllene (22,61%), caryophyllene oxide (5,83%) dan Veridiflorol (8,78%) yang merupakan senyawa golongan terpenoid (monoterpen dan sekuiterpen). Analisis ini sesuai profil kromatogram hasil KTL menggunakan fase diam silica gel GF254 dan fase gerak heksan-etilasetat (5 : 0,5), yaitu terdapat 5 spot besar berwarna ungu pada penyemprotan dengan CcSO4. Uji antimikroba dengan metode difusi agar terhadap bakteri uji E.coli S. aureus, Salmonella sp, dan Candida sp. menunjukkan bahwa minyak atsiri memiliki daya antimikroba yang lemah dengan nilai kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) sebesar 70% pada uji dengan metode dilusi.