Die Rolle der microRNAs und Dicer in Entzündungszellen von Atemwegserkrankungen

Doctoral thesis German OPEN
Thiele, Stefanie (2010)
  • Subject: Small RNA | Makrophage | T-Lymphozyt
    • ddc: ddc:570

Atemwegserkrankungen stellen ein weltweites Gesundheitsproblem dar und sind durch die Infiltration der Atemwege durch Immunzellen und die daraus resultierende Entzündung charakterisiert. Antientzündliche Therapieansätze sind daher am wichtigsten und effektivsten. Speziell für die Behandlung von Atemwegserkrankungen am Patienten ist eine effiziente topische Verabreichung von Therapeutika über die Atemwege wünschenswert. Small interfering RNAs (siRNAs) können Gene posttranskriptionell regulieren und ihr Potential zur topischen Applikation liegt aufgrund ihrer geringen Größe von 21 - 25 bp nahe. Eine Zielsetzung dieser Arbeit war es deshalb, siRNAs als neuen möglichen Untersuchungs- und Therapieansatz für topische Applikationen in die Atemwege anhand eines Tiermodells zu analysieren. Hierbei wies die intratracheale (i.t.) gegenüber der intranasalen (i.n.) Applikation eine geringfügig höhere Aufnahmekapazität der siRNA durch Lungenzellen auf. Bei der additiven Gabe von drei verschiedenen Transfektionsreagenzien in vivo verursachte LipofectamineTM 2000, gemessen an der Neutrophileninfiltration und Sekretion von TNF-alpha, die geringste Entzündungsauslösung. Zusammenfassend zeigt der erste Teil der Arbeit, dass siRNAs Potential als Therapeutika besitzen. Die Untersuchungen der letzten Dekaden wiesen den si- und miRNAs (microRNAs)eine wichtige Rolle bei der posttranskriptionellen Regulation von Genen zu. Dicer ist essentiell an der Prozessierung reifer si- und miRNAs beteiligt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte daher die funktionelle Rolle von Dicer in Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen, Immunzellen in der Pathogenese von Atemwegserkrankungen, analysiert werden. Dies sollte durch die gezielte Deletion von Dicer in diesen spezifischen Zelltypen mit Hilfe des loxP/Cre Systems erzielt werden. Hierfür wurden transgene Dicer-Mäuse mit transgenen LysMCre Mäusen verpaart, woraufhin Cre unter dem LysM Promotor spezifisch in Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen exprimiert wird und so zur Deletion von Dicer führen sollte. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten LysMCre+/+/Dicerfl/fl Mäuse wiesen jedoch keine vollständige Dicer Defizienz in Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen auf, was auf eine gering spezifische Cre Aktivität zurückzuführen ist. Doch bereits eine unvollständige Deletion von Dicer führte zu einer verminderten Zellzahl aktivierter Monozyten, die in die Lunge und das Peritoneum nach Provokation infiltrierten. Dies deutet darauf hin, dass Dicer in die Proliferation von Monozyten involviert ist. Um eine höhere Deletionseffizienz zu erzielen, wurde eine weitere transgene Maus generiert, wobei Dicer auf einem Allel bereits während der frühen embryonalen Entwicklung deletiert wird. Eine weitere Möglichkeit für die Untersuchung des RNAi-Mechanismus bietet auch die direkte Analyse der miRNAs. Hierfür wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit miRNA-Profile von aktivierten humanen Monozyten und CD4+ T-Zellen erstellt. Eine Herunterregulation der miRNA-Expression um mindestens 50% wurde in aktivierten Monozyten von fünf miRNAs (miR-16, miR 25, miR 101, miR 146a, miR 340) und in aktivierten CD4+ T-Zellen von sieben miRNAs (miR 10a, miR 22, miR 26a, miR 26b, miR 190, miR 200c, miR 425) bestimmt. Aufgrund der ebenfalls ermittelten Veränderungen der miRNA-Expressionsmengen nach prophylaktischer Gabe von Dexamethason und Cyclosporin A konnte eine regulatorische Interaktion zwischen Immunsuppressiva und miRNAs nachgewiesen werden. Eine Vielzahl der Resultate unterschiedlicher Analysemethoden war jedoch nicht untereinander vergleichbar. Weitere Verifizierungen der Expression wurden benötigt, bevor einzelne miRNAs für fortführende funktionelle Untersuchungen herangezogen werden konnten. In aktivierten CD4+ T-Zellen konnte so die Expression der miR-9 und miR-197 durch quantitative Real-time RT-PCR als 3 fach bzw. 2,6 fach hochreguliert analysiert werden. Eine Inhibition der beiden miRNAs führte zu einem Expressionsanstieg der zwei Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und Bcl-6. Dies resultierte wiederum in einer Reduktion der IL-2- und IFN-gamma-Sekretion. Infolge dessen wurde ein neues Modell der Regulationsmechanismen in aktivierten CD4+ T-Zellen erstellt. Die IL-2-Sekretion wird durch die Reduktion von Blimp-1 induziert, was wiederum aus einer direkt bzw. indirekt vermittelten posttranskriptionellen Inhibition durch die verstärkte miR-9- bzw. miR-197 Expression resultiert. Die miR-9 bindet dabei direkt an die 3UTR von Blimp-1 und miR-197 vermutlich an die 3UTR eines Aktivators von Blimp-1. Des Weiteren führt die von miR-9 und miR-197 verursachte posttranskriptionelle Inhibition von Blimp-1 und Bcl-6 zu einer verstärkten Produktion von IFN-gamma. Asthma bronchiale and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are both very common and their incidence increases globally. Both diseases are characterized by the inflammation of airways through infiltrating immune cells, like granulocytes and T cells. Therefore, antiinflammatory therapies are necessary and effective. Efficient topical application of drugs for the treatment of airway diseases in patients is desirable. Small interfering RNAs (siRNAs) are posttranscriptional regulators of genes and their potential for topic applications is indicated by their small size of 21 to 25 bp. In the first part of this thesis, the possibility of siRNA as new therapeutic approaches for the topical application was determined in animal models. An insignificant greater uptake efficiency of siRNA from lung cells was detectable by intratracheal (i.t.) than by intranasal (i.n.) application. Three various transfectionreagents were additive applied in vivo. LipofectamineTM 2000 caused the least inflammation, determined by infiltration of neutrophils and secretion of the proinflammatory cytokine TNF-alpha. In summary, the potential of siRNAs for new therapeutic approaches is demonstrated. Nevertheless, the commitment of siRNA for therapeutic topical administration needs to be further investigated. Analysis of the last decades identified an important role of si- and miRNAs (microRNAs) in the posttranscriptional regulation of genes. Dicer is essential for processing of mature si- and miRNAs. In the second part of this thesis, the functional role of Dicer was analyzed in monocytes/macrophages and neutrophils. Both are major immune cells in the pathogenesis of asthma bronchiale and COPD. Thus, the loxP/Cre system was used to achieve a selective deletion of Dicer in these two specific cell types. A transgenic Dicer mouse was crossed with a transgenic LysMCre mouse to express Cre under the promoter of LysM and to establish a specific deletion of Dicer in monocytes/macrophages and neutrophils. A complete deletion of Dicer in the generated LysMCre+/+/Dicerfl/fl mice was not detectable due to the minor specific activity of Cre. Nevertheless, a partial deletion of Dicer caused a diminished cell number of monocytes, which were infiltrated into the lung and the peritoneum upon provocation. An involvement of Dicer in proliferation of monocytes is indicated. To achieve an increased efficiency of deletion an additional transgenic mouse was generated. At this time, Dicer should be deleted on one allele during the early embryonal development. Beside the deletion of Dicer, the analysis of miRNAs presents an alternative to investigate the RNAi mechanism. Therefore, miRNA profiles were established in activated human monocytes and CD4+ T cells. In activated monocytes the expression of five miRNAs (miR 16, miR 25, miR 101, miR 146a, miR 340) and the expression of seven miRNAs in activated CD4+ T-cells (miR 10a, miR 22, miR 26a, miR 26b, miR 190, miR 200c, miR 425) were downregulated by at least 50%. The expression levels of these miRNAs were consistently detected with two different analysis methods. The results of all other miRNAs could not be confirmed by using various methods. Due to altered miRNA expression levels upon administration of dexamethasone and cyclosporin A, a regulatory interaction between immunosuppressive compounds and miRNAs could be demonstrated. The results of different analysis methods were not comparable. Further verification of particular miRNAs of intererest was required. As a consequence of quantitative real-time RT-PCR analysis, the expression of miR-9 and miR-197 was 3 fold and 2.6 fold upregulated in activated CD4+ T-cells, respectively. An inhibition of both miRNAs induced the expression of two transcription factors, Blimp-1 and Bcl-6. This resulted in a reduced secretion of IL-2 and IFN-gamma. In summary, a new model of the regulatory mechanism in activated CD4+ T-cells was compiled: IL-2 secretion is enhanced by Blimp-1 reduction as a result of posttranscriptional repression mediated directly by enhanced miR-9 and indirectly by enhanced miR-197 expression. The mir-9 directly binds to the 3UTR of Blimp-1, whereas, the miR-197 probably binds to the 3UTR of an activator of Blimp-1. The posttranscriptional inhibition of Blimp-1 and Bcl-6 caused by miR-9 and miR-197 leads additionally to an enhanced production of IFN-gamma.
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