Isolation und Charakterisierung retroviraler Partikel und Proteine zur Untersuchung immunsuppressiver Effekte

Doctoral thesis German OPEN
Pietsch, Heiko (2016)
  • Publisher: Freie Universität Berlin
  • Subject: Medizin
    • ddc: ddc:610

Obgleich auf dem Gebiet der Transplantationsmedizin in jüngster Zeit beachtliche Fortschritte erzielt worden sind, ist der Mangel an Organspendern ein fortbestehendes Problem. Im Rahmen der Xenotransplantation können Schweine als Spender zur Transplantation von Zellen oder Organen beim Menschen dienen. Um die Sicherheit der Xenotransplantation zu gewährleisten, ist sowohl die Entwicklung sensitiver Nachweismethoden als auch die Einschätzung des Gefahrenpotentials durch eine Infektion für den Empfänger des Transplantates bedeutend. Zudem sollte im Falle einer humanen Zoonose ein effektiver Impfstoff verfügbar sein. Im Fokus einer möglichen Pathogentransmission stehen dabei insbesondere die porcinen endogenen Retroviren (PERV), welche sich nicht vollständig aus dem Genom der Spendertiere eliminieren lassen. Vorherige Studien zeigten, dass die immunsuppressiven Eigenschaften endogener retroviraler Partikel der isu-Domäne des viralen Oberflächenproteins zugeschrieben werden können. Weiterhin ist bekannt, dass eine Immunisierung mit einem isu-mutierten Virus zu einer gesteigerten Antikörperproduktion im Wirt führt. Ziel der Arbeit war die Sekretion des viralen Oberflächenproteins p15E-Proteins von PERV sowie eine Charakterisierung der immunsuppressiven Eigenschaften endogener retroviraler Partikel bzw. dessen transmembranen Oberflächenproteins p15E.<br> Virale Partikel des PERV und MuLV wurden dazu aus dem Überstand infizierter Zellkulturen isoliert. Um eine Gewinnung des Oberflächenproteins von PERV in einem großem Maßstab zu ermöglichen, sollte eine Transfektion eukaryotischer Zellen mit einem Molekularklon erfolgen. Da die Klonierung der env-Sequenz des PERV fehlschlug, wurde das pOUT-Konstrukt erstellt und kommerziell im Auftrag synthetisiert. Dieses Konstrukt codiert das transmembrane Oberflächenprotein p15E von PERV und enthält zudem Sequenzen, die eine starke Expression und Sekretion in eukaryotischen Zellen ermöglichen. Durch die Tags des pOUT wurden ein Nachweis und eine effektive Reinigung des p15E-Proteins ermöglicht.<br> Der Parameter der Interleukin-10-Freisetzung sollte als Indikator für eine Immunsuppression in vivo dienen. Dazu wurden isolierten viralen Partikel und Proteine zu PBMCs gegeben, und die Freisetzung des Interleukin-10 aus diesen Zellen wurde gemessen.<br> Virale Partikel des MuLV sowie das sekretierte p15E-Protein des PERV, nicht jedoch isolierte virale Partikel des PERV, bewirkten die Freisetzung des IL-10 aus PBMCs. Die Isolate wurden mittels Western Blot- und PCR-Analyse verifiziert. Die Bedeutung der IL-10-Freisetzung in vitro konnte nicht abschließend beurteilt werden und es blieb unklar, ob die Induktion des IL-10 als exklusiv relevanter Parameter zur Erfassung der Immunsuppression in vivo dienen kann. Mit dem pOUT-Konstrukt steht letztendlich ein effektives System zur Sekretion und Reinigung von Proteinen aus dem Überstand eukaryotischer Zellen zur Verfügung, dessen Aufbau die Sekretion von weiteren Proteinen ermöglicht.
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