Etude d'un continuum de lumière en régime femtoseconde. Applications au domaine biologique : microscopies et spectroscopie en temps résolu.

Doctoral thesis French OPEN
Courvoisier , Céline (2006)
  • Publisher: HAL CCSD
  • Subject: Femtosecond supercontinuum of light | Time of fligh | Continuum de lumière | Temps de vol | Confocal microscopy | fluorescence | Microscopie | Microscopie confocale | STED | Intercorrelation | [ PHYS.PHYS.PHYS-BIO-PH ] Physics [physics]/Physics [physics]/Biological Physics [physics.bio-ph] | Microscopy

For few years, a new type of source, called "continuum of light", has been developed. It presents many advantages like a wideband spectrum, a huge brilliancy, a pulsed nature. The aim of this work is to perform a complete characterization of a continuum generated by the injection of femtosecond pulses into a microstructured fiber, and to consider the use of this continuum as optical source for biomedical applications.<br />With acousto-optic filters, the continuum has been successfully employed as tunable source for fluorescence microscopy. Confocal images of biological samples, which were marked by several fluorophores, were recorded. Moreover, we studied and checked the use of the continuum in a STED microscopy set-up, allowing the acquisition of ultra-resolved images with a spectral versatility.<br />A third application is an optical probe, developed to realize time of flight infra-red spectroscopy on in vivo turbid media, like muscle, bone, marrow of bone... This type of instrument allowed the retrieval of physiological parameters characteristic of the energetic metabolism of those tissues.; Le but de cette thèse est de caractériser un continuum généré en régime femtoseconde dans une fibre microstructurée (puissance spectrale, durée des pulses, fluctuations tir à tir) et de valider son utilisation comme source optique dans des instrumentations dédiées aux domaines biologique et clinique.<br />La première application est l'élaboration d'un microscope confocal de fluorescence entièrement versatile en longueur d'onde : le continuum, filtré par un cristal acousto-optique, est ainsi utilisé comme une source accordable permettant l'excitation de n'importe quel fluorophore. Des images de cellules identifiées par différents marqueurs ont été réalisées.<br />Afin de disposer d'un outil alliant une grande versatilité spectrale à une très haute résolution spatiale, le dispositif précédent a été modifié en un microscope STED. Notre continuum est trop peu énergétique pour apporter une validation expérimentale, mais des simulations numériques prenant en compte les fluctuations du continuum permettent d'estimer que la résolution latérale peut atteindre 90 nm, voire 35 nm pour les pulses les plus puissants.<br />La troisième application est l'utilisation du continuum en tant que source large bande pulsée pour une expérience de spectroscopie de temps de vol dans les milieux diffusants tels le muscle, l'os, la moelle osseuse. Grâce à un modèle adapté de propagation de la lumière, les coefficients d'absorption, de diffusion et d'anisotropie des tissus ont été extraits des traces expérimentales, avec d'autant plus de précision que la plage spectrale utilisée est grande.<br />Même si des améliorations sont attendues, l'emploi de continua en microscopie de fluorescence et en spectroscopie est validé.
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    3 Microscopie STED 95 3.1 Amélioration de la résolution en microscopie optique . . . . . . . . . . . . . . . 96 3.2 Principe de la microscopie STED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 3.2.1 Aspect temporel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 3.2.2 Aspect spatial et spectral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 3.3 Simulations numériques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 3.3.1 Comportement tir à tir du continuum de lumière . . . . . . . . . . . . . . 104 3.3.2 Influence des fluctuations du continuum sur la dépletion de fluorescence 108 3.3.3 Influence des fluctuations du continuum sur la résolution latérale . . . . . 110 3.4 Montage expérimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 3.4.1 Présentation générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 3.4.2 Méthode de séparation des faisceaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 3.4.3 Méthode de mise en forme spatiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 3.4.3.1 Réalisation et caractérisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 3.4.3.2 Simulation de la tache STED attendue après focalisation . . . . 127 3.4.4 Expérimentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 3.4.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

    4 Spectroscopie de temps de vol : physiologie des milieux diffusants 135 4.1 Modèle théorique de propagation de la lumière . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 4.2 Présentation du système de spectroscopie de temps de vol . . . . . . . . . . . . . 141 4.2.1 Montage expérimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 4.2.2 Calibration instrumentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 4.3 Mesures de spectroscopie de temps de vol en milieux diffusants . . . . . . . . . 146 4.3.1 Spectroscopie de temps de vol dans le tissu musculaire . . . . . . . . . . 148 4.3.1.1 Mesures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 4.3.1.2 Traitement des données et résultats . . . . . . . . . . . . . . . 151 4.3.2 Spectroscopie de temps de vol dans le tissu osseux . . . . . . . . . . . . 154 4.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

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