Ensayos cristalográficos de complejos de ADN con proteínas HMG-box y fármacos

Master thesis Spanish; Castilian OPEN
Gomez Jimenez, Fabiola Alejandra (2016)
  • Publisher: Universitat Politècnica de Catalunya
  • Subject: ADN -- Interaccions de les proteïnes | Nuclear proteins | DNA-protein interactions | :Enginyeria biomèdica [Àrees temàtiques de la UPC] | Proteïnes nuclears

Las HMGB son proteínas nucleares que presentan el motivo “HMG-box”, con el que se unen al surco estrecho del ADN. Producen cambios estructurales en el mismo y están implicadas en diferentes enfermedades por lo que el estudio estructural de dichas proteínas unidas a ADN es de importancia en el desarrollo de estrategias terapéuticas. Por otra parte, los compuestos derivados de difenilo bisimidazolinio también se unen al surco estrecho del ADN, específicamente en zonas ricas en AT (adenina-timina). Por ello se estudian como potentes compuestos contra enfermedades tropicales causadas por la transmisión de parásitos cuyo genoma es rico en AT. Mediante este proyecto se estudia la interacción con el surco estrecho del ADN, en zonas ricas en AT, de un fármaco derivado de difenilo bisimidazolinio y de proteínas HMGB (NHP6A y HMGB1 box B). Para ello se expresó y purificó la proteína NHP6A, se obtuvo cristales de complejos de ADN con la proteína NHP6A, HMGB1 box B y el fármaco CRMV50; y se difractó mediante rayos X los cristales obtenidos. La proteína NHP6A se obtuvo mediante la técnica del ADN recombinante, transformando la bacteria Escherichia coli (cepa BL21(DE3)pLysS) con el plásmido pRJ1228. Este plásmido contiene el gen que codifica la proteína NHP6A y un gen que le confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina (lo que permitió su selección). La expresión de la proteína se indujo mediante la adición de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). Una vez expresada la proteína, se rompió la célula mediante sonicación para extraerla de su interior; y se hizo un fraccionamiento inicial del extracto mediante la adición de TCA para retirar proteínas contaminantes. Luego, se realizó una serie de cromatografías para purificar la proteína. Particularmente, se utilizó una cromatografía de intercambio catiónico (separación por carga) y una de exclusión molecular (separación por tamaño). Se realizaron ensayos cristalográficos de complejos proteína-ADN o fármaco-ADN, empleando la técnica de difusión de vapor en gota colgante, a diferentes condiciones de cristalización. Se obtuvieron cristales de buen tamaño y homogéneos a partir de NHP6A, HMGB1 box B y el fármaco CRMV50 (fármaco derivado de difenilo bisimidazolinio) con el oligonucleótido AATTTAAATT. Éstos fueron capturados, congelados y difractados mediante rayos X en el sincrotrón ALBA. Los datos obtenidos se procesaron mediante diferentes programas de ordenador para predecir las características básicas de cada estructura
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